L'acquisition de fluorescence Time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes

Summary

Nous présentons un protocole simple d'obtenir des films de microscopie par fluorescence de cellules de levure en croissance, et un logiciel GUI basée à extraire des données de séries chronologiques unicellulaires. L'analyse comprend lignée automatisé et l'affectation du temps de division intégrée à l'inspection visuelle et la conservation manuelle de données à chenilles.

Abstract

Microscopie time-lapse fluorescence est devenu un outil puissant dans l'étude de nombreux processus biologiques au niveau d'une seule cellule. En particulier, les films dépeignant la dépendance temporelle de l'expression des gènes permettent de mieux comprendre la dynamique de sa réglementation, mais il ya beaucoup de défis techniques à obtenir et à analyser les films de fluorescence des cellules individuelles. Nous décrivons ici un protocole simple en utilisant un dispositif de culture microfluidique disponible dans le commerce pour produire ces données, et une interface graphique basée sur MATLAB utilisateur (GUI) basée sur logiciel pour quantifier les images de fluorescence. Les segments des logiciels et des cellules de pistes, permet à l'utilisateur de vicaire visuellement erreurs dans les données, et attribue automatiquement lignage et des temps de division. L'interface graphique analyse en outre la série temporelle afin de produire des traces de cellules entières, ainsi que leurs dérivées première et seconde de temps. Bien que le logiciel a été conçu pour S. cerevisiae, sa modularité et sa polyvalence devrait lui permettre de to servir de plate-forme pour l'étude d'autres types cellulaires avec quelques modifications.

Introduction

Analyse unicellulaire de l'expression génique a permis de mieux comprendre de nombreux aspects de la régulation des gènes. Instantanés statiques d'expression rapporteur fluorescent par cytométrie en flux ou microscopie fournissent des informations utiles sur la distribution de l'expression seule cellule, mais n'ont pas l'histoire et l'évolution des données de séries chronologiques nécessaires pour informer directement la dynamique de l'expression des gènes. Microscopie time-lapse fluorescence présente un moyen d'obtenir deux mesures unicellulaires et leur histoire. Diverses techniques expérimentales et analytiques ont été développées afin d'obtenir et de quantifier les films d'expression rapporteur fluorescent, conférant ainsi un aperçu des caractéristiques de régulation des gènes (cf. ¹ pour une revue) tels que la variation de cellule de la cellule ^2,3, la formation de persister bactérienne ^4, transcription initiation et d'élongation ^5, transcription éclatement ^6,7, la dépendance du cycle cellulaire ^8,9 et héritabilité ^10. Cependant, obtaining série temporelle de fluorescence unicellulaire qualité implique des difficultés techniques importantes dans la culture d'une monocouche de cellules dans un environnement contrôlable dans la quantification et à haut débit des films de fluorescence acquises. Ici, nous décrivons une procédure pour obtenir et analyser des films de fluorescence de S. cerevisiae avec aucune expérience requise dans la fabrication du dispositif de culture cellulaire ou dans le développement de logiciels (Figure 1).

Tout d'abord, nous détaillons un protocole d'exemple pour produire des films de séries chronologiques de fluorescence pour levure bourgeonnante exprimant un ou plusieurs rapporteurs fluorescents. Bien que des chambres de culture microfluidiques personnalisés ont été construits et utilisés avec succès précédemment ^11-13, nous utilisons un dispositif microfluidique disponible dans le commerce à partir de CellAsic (Hayward, CA). Le système confine à la croissance des cellules de la monocouche et permet un contrôle continu du milieu de perfusion. Le protocole de microscopie que nous présentons est un moyen simple d'obtenir Déessfilms rence de levure bourgeonnante, mais tout protocole modifié expérimental (un dispositif de culture personnalisée, les conditions de médias alternatifs, etc.) fournissant des données de films similaires fluorescence de cellules de levure simples peuvent être substitués.

Ensuite, nous présentons l'analyse des films en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) basée sur logiciel dans MATLAB (The MathWorks, Natick, MA), surnommé le GUI pour l'analyse rapide des séries chronologiques Fluorescence (greffes), pour extraire des données de séries chronologiques pour des cellules individuelles. GREFFES a des caractéristiques similaires à la polyvalente, logiciel open-source paquet Cell-ID ¹⁴ dans la segmentation et le suivi des cellules et dans l'extraction de l'intensité de fluorescence et de l'information géométrique. Toutefois, les greffes fournit d'importantes fonctionnalités supplémentaires. Tout d'abord, il offre une édition interactive facile de segmentation et le suivi des résultats afin de vérifier l'exactitude des données, plutôt que de simplement gating statistique des traces de la région aberrantes après analyse. En outre, elle étend l'analyse aux automatically désigné lignée et les points du cycle cellulaire d'intérêt de la levure bourgeonnante. Déterminer le moment où mère et fille se divisent pour former deux régions de cellules indépendantes est cruciale pour déterminer les mesures à travers le cycle cellulaire ⁸ cellules entières (y compris toute mère bourgeon connecté). La suite se compose de trois modules pour accomplir ces tâches. Les premières régions cellulaires segments basé sur le contraste entre les images de champ lumineux ciblés et non ciblés, et permet à l'utilisateur de définir et de tester visuellement les paramètres de segmentation. La seconde pistes (. Utilisant Blair et la mise en œuvre de la MATLAB Crocker et al IDL routine de Dufresne, disponible sur: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) et les mesures régions cellulaires à travers le temps; attribue automatiquement lignées et permet une inspection visuelle et la correction d'erreur. Une interface graphique tracé simple est inclus aux propriétés unicellulaires requête. Le troisième module attribue bourgeon émergence et la division times, et délivre des données de séries chronologiques de cellules entières ainsi que leurs dérivées premières et secondes de temps (tel que discuté dans ^9). Le module d'analyse fournit en sortie les données dans un fichier de texte délimité par des espaces pour l'étude ultérieure dans le logiciel de statistique de choix. Ainsi, le forfait permet à l'utilisateur d'extraire des données de séries chronologiques de haute qualité par le biais d'une interface graphique. Nous avons utilisé cette méthode pour estimer les taux de transcription en temps réel dans des cellules de levure bourgeonnante simples en fonction du cycle cellulaire ^9. Alors que les modules ont été optimisés pour levure bourgeonnante, les paramètres ou, le cas échéant, le code librement disponible peut être adapté à d'autres organismes et les types d'images. Segmentation, le suivi, et la lignée des algorithmes d'affectation peuvent être spécifiques à types d'imagerie affecté et l'organisme en question. Les algorithmes existants pourraient être remplacés, mais conservent l'interface graphique qui permet une inspection visuelle conviviale et la correction des erreurs de segmentation et de suivi qui invariablement occupantsr avec n'importe quel algorithme.

Protocol

1. Obtenir fluorescentes microscopie Films de cellules de levure unique qui poussent dans une chambre microfluidique Inoculer 1 ml médias SC (médias définis synthétiques avec 2% de glucose et le complément complet d'acides aminés) avec des cellules d'une plaque fraîchement croissante, et incuber la culture de la nuit environ 16 heures sur un tambour à rouleaux à 30 ° C. Préparer la culture tels que le DO finale 600nm est d'environ 0,1 pour une croissance en phase logarithmiqu…

Representative Results

Une expérience réalisée et analysée avec succès donnera série surtout à temps continu pour les cellules entières simples avec réalisme attribué apparition des bourgeons et des temps de division. À titre d'exemple, nous avons réalisé le protocole ci-dessus avec une souche de levure haploïde exprimant une copie intégrée de la protéine fluorescente Cerulean (CFP) entraînée par le promoteur constitutif ADH1 d'observer comment la croissance et l'expression globale peuvent vari…

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit une méthode simple pour obtenir et analyser des données de séries chronologiques de fluorescence avec une expérience limitée en microfluidique ou dans le développement de logiciels. Il permet d'obtenir time-lapse films de fluorescence des cellules de levure simples; extraire la taille des cellules pertinentes et les mesures d'expression; suivi curé et missions de la lignée, et analyser le comportement des cellules entières dans le temps en utilisant un dispositif de cultur…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit