出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析
Summary
我々は、単一セルの時系列データを抽出するために蛍光成長酵母細胞の顕微鏡ムービー、GUIベースのソフトウェアパッケージを取得する単純なプロトコルを提示する。分析では、目視検査と追跡対象データの手動キュレーションと統合され自動化された系統と分裂時間の割り当てが含まれています。
Abstract
蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一細胞レベルでの多くの生物学的過程の研究の強力なツールとなっています。具体的には、遺伝子発現の時間依存性を示すムービーは、その規制のダイナミクスへの洞察を提供するが、単一細胞の蛍光ムービーを取得し、分析する多くの技術的課題がある。ここでは、そのようなデータを生成するために市販のマイクロ流体培養装置を用いた単純なプロトコル、およびMATLABベースのグラフィカル·ユーザー·インターフェース（GUI）系蛍光画像を定量化するためのソフトウェアパッケージを説明する。ソフトウェアセグメントとトラックセル、ユーザが視覚的にデータのエラーをキュレーションすることができますし、自動的に系統と分裂時間を割り当てます。 GUIはさらに、全細胞トレースならびにそれら第一及び第二の時間導関数を生成するために時系列を解析する。ソフトウェアはS.のために設計されましたが出芽酵母は、そのモジュール性と多様性は、それトン許可する必要がありますいくつかの変更を他の細胞型を研究するためのプラットフォームとしての役割を果たす、Ø。
Introduction
遺伝子発現の単一細胞解析は遺伝子調節の多くの側面の我々の理解を進めたた。フローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて蛍光レポーター発現の静的なスナップショットは、単一セルの発現の分布に有用な情報を提供するが、直接遺伝子発現動態を通知するために必要な時系列データの履歴と進化を欠いている。蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一セルの測定とその歴史の両方を取得する手段を提供します。種々の実験および解析技術は、このような遺伝子調節機能洞察を付与する、蛍光レポーター発現の映画を取得し、定量化するために開発されている（概説1を参照）は、セル間のばらつき2,3、細菌persister形成4、転写として開始と伸長5、6,7を破裂転写、細胞周期依存性8,9、および遺伝10。しかし、OBTaining品質単一細胞蛍光時系列は、培養の重要な技術的課題に制御環境で、取得した蛍光映画のハイスループット定量化における細胞の単層を伴う。ここでは、Sの蛍光ムービーを取得し、分析するための手順を説明細胞培養装置の製造における、またはソフトウェア開発の経験のない必須（ 図1） セレビシエ 。
まず、我々は詳細例プロトコルを一つ以上の蛍光レポーターを表現する出芽酵母用蛍光時系列ムービーを生成する。カスタマイズされたマイクロ流体文化室が建設され、成功した以前に11-13採用されてきたけれども、我々はCellAsic（ヘイワード、カリフォルニア州）から市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。システム閉じ込める単分子層の成長への細胞とは、灌流環境の継続的な制御が可能になります。我々は提示顕微鏡プロトコルはfluorescを取得するための簡単な手段です。単一の酵母細胞の蛍光類似動画データを得レンス出芽酵母の映画が、任意の修飾実験プロトコルは、（カスタマイズ培養装置、代替メディア条件等 ）置換されていてもよい。
次に、時系列データを抽出するためにグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）系蛍光時系列の迅速分析（移植片）のためのGUIと呼ばれるMATLABのソフトウェアパッケージ（Mathworks社、ナティック、MA）を使用して、映画の分析を概説単一細胞のために。移植片は、細胞をセグメント化し、追跡すると蛍光強度と幾何学的な情報を抽出することで汎用性の高い、オープンソースのソフトウェアパッケージセルID 14と同様の機能を備えています。しかし、移植片は重要な追加機能を提供します。まず、セグメンテーションとデータの正確性ではなく、分析後の外れ値の領域のトレースだけ統計ゲーを確認するために追跡の結果を簡単にインタラクティブな編集を提供しています。また、分析にautomaticallに延びyは出芽酵母の関心系統および細胞周期の点を指定する。母と娘は、2つの独立したセル領域を形成するために分割したときに決定することは、セル全体（任意の接続つぼみ含む母）細胞周期8全体の測定値を決定する非常に重要です。スイートは、これらのタスクを達成するために3つのモジュールから構成されています。最初のセグメントはセル領域に焦点を当てたとやり場の明視野像との対比に基づいており、ユーザが定義し、視覚的にセグメントパラメータをテストすることができます。第二トラック（クロッカーら IDLルーチンのブレアとデュフレーヌのMATLAB実装を使用して、で入手可能：。 http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ）および時間を介して細胞領域を測定し、自動的に系統を割り当て、および目視検査を可能にする誤り訂正。シンプルなプロットのGUIは、クエリの単一セルのプロパティに含まれています。第三のモジュールは、つぼみ出現と分裂TIを帰しMES、および全細胞時系列データならびにそれら第一及び第二の時間導関数を（9などを参照）を出力する。解析モジュールは、選択した統計ソフトウェアでその後の研究のためのスペース区切りのテキストファイルとしてデータを出力します。したがって、パッケージは、ユーザがグラフィカル·インターフェースを介して高品質の時系列データを抽出することができます。我々は、細胞周期9の関数として単一出芽酵母細胞内でリアルタイムの転写率を推定するためにこの方法を使用している。モジュールは出芽酵母のために最適化されているが、パラメータや、必要に応じて、自由に利用可能なコードは、他の生物やイメージタイプに適合させることができる。セグメンテーション、トラッキング、系統割り当てアルゴリズムは、割り当てられたイメージングおよび問題の生物の種類に特異的であり得る。既存のアルゴリズムが置き換えられますが、それでもユーザーフレンドリーな目視検査とセグメンテーションの補正と常にoccuトラッキングエラーを可能にするGUIインタフェースを保持することができます任意のアルゴリズムでR。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルでは、マイクロ流体、またはソフトウェア開発の限られた経験を有する蛍光時系列データを取得して分析するための簡単な方法が記載されている。バーテン追跡および系統の割り当て;、関連するセルサイズおよび発現測定値を抽出し、それは1つは、単一の酵母細胞の経時蛍光ムービーを取得することができ、市販のマイクロ流体培養装置を用いて、時間と汎用性の高?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ソフトウェア上のコメントにエミリージャクソン、ジョシュアZeidman、そしてニコラスレンに感謝します。この作品はGM95733（NM）に、BBBE 103316とMITスタートアップ資金（NMへ）によって賄われていた。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
