Anskaffelse Fluorescens Time-lapse filmer av Spirende gjær og analysere encellede Dynamics bruke grafts

Summary

Vi presenterer en enkel protokoll for å få fluorescens mikroskopi filmer av voksende gjærceller, og et GUI-basert programvare pakke for å trekke encellede tidsserier. Analysen omfatter automatiserte avstamning og divisjon tid oppdraget integrert med visuell inspeksjon og manuell curation sporede data.

Abstract

Fluorescens time-lapse mikroskopi har blitt et kraftig verktøy i studiet av mange biologiske prosesser på enkelt-celle-nivå. Spesielt filmer som skildrer den timelige avhengighet av genuttrykk gi innsikt i dynamikken i reguleringen sin, men det er mange tekniske utfordringer for å skaffe og analysere fluorescens filmer av enkeltceller. Vi beskriver her en enkel protokoll med en kommersielt tilgjengelig microfluidic kultur-enhet for å generere slike data, og en MATLAB-basert, grafisk brukergrensesnitt (GUI)-basert programvarepakke for å kvantifisere fluorescens bilder. Programvaren segmenter og spor celler, gjør det mulig for brukeren å visuelt kuratere feil i dataene, og automatisk tildeler avstamning og divisjon ganger. Det grafiske analyserer ytterligere tidsserien å produsere helcelle spor samt deres første og andre tidsderiverte. Mens programvaren er designet for S. cerevisiae, bør modularitet og fleksibilitet gjør det to tjene som en plattform for å studere andre celletyper med noen modifikasjoner.

Introduction

Encellet analyse av genuttrykk har fremmet vår forståelse av mange aspekter ved genregulering. Statiske øyeblikksbilder av fluorescerende reporter uttrykk ved hjelp av flowcytometri eller mikroskopi gi nyttig informasjon om fordelingen av encellede uttrykk, men mangler historien og utviklingen av tidsserier som kreves for å informere direkte genuttrykk dynamikk. Fluorescens time-lapse mikroskopi presenterer et middel for å oppnå begge encellede målinger og deres historie. Ulike eksperimentelle og analytiske teknikker har blitt utviklet for å skaffe og kvantifisere filmer av fluorescerende reporter uttrykk, og dermed formidle innsikt i genregulering funksjoner (se ¹ for en gjennomgang) som celle-til-celle variasjon ^2,3, bakteriell persister formasjon ^4, transkripsjon initiering og ^fem forlengelse, transkripsjonell sprengning ^6,7, celle-syklus avhengighet ^8,9, og ¹⁰ arvbarhet. Men OBTaining kvalitet encellede fluorescens tidsserier innebærer betydelige tekniske utfordringer i dyrking en monolags av celler i et kontrollerbart miljø og i high-throughput kvantifisering av de oppkjøpte fluorescens filmer. Her beskriver vi en prosedyre for å innhente og analysere fluorescens filmer av S. cerevisiae uten nødvendig erfaring i cellekultur enhet produksjon eller i utvikling av programvare (figur 1).

Først detalj vi et eksempel protokollen til å generere fluorescens tidsserier filmer for spirende gjær uttrykker en eller flere fluorescerende reportere. Selv tilpassede microfluidic kultur kamre har blitt bygget og vellykket ansatt tidligere ^11-13, bruker vi en kommersielt tilgjengelig microfluidic enheten fra CellAsic (Hayward, CA). Systemet confines celler til monolag vekst og tillater kontinuerlig styring av perfusjon miljø. Den mikroskopi protokollen presenterer vi er et enkelt middel for å oppnå fluorescerendefaset filmer av spirende gjær, men noe modifisert eksperimentelle protokollen (en tilpasset kultur-enhet, alternative medier forhold, etc.) ved samme fluorescens filmdataene av single gjærceller kan erstattes.

Deretter skissere vi analysen av filmer ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt (GUI)-basert programvarepakke i MATLAB (Mathworks, Framingham, MA), kalt GUI for Rapid Analyse av fluorescens Time Series (grafts), for å trekke tidsserier for enkeltceller. Grafts har lignende funksjoner til allsidig, open-source programvare pakken Cell-ID ¹⁴ i segmentering og sporing celler og i å trekke fluorescens intensitet og geometrisk informasjon. Imidlertid gir grafts viktige tilleggsfunksjoner. Først, det tilbyr enkel interaktiv redigering av segmentering og sporing resultater for å verifisere data nøyaktighet, heller enn bare statistisk gating av avvikende regionen spor etter analyse. Videre utvider den analysen til automatically utpeke avstamning og celle-syklus interessante av spirende gjær. Bestemme når mor og datter deler for å danne to uavhengige celle regionene er avgjørende for å avgjøre hele celler (mor inkludert eventuelle koblet knopp) målinger gjennom hele cellesyklus ^åtte. Suiten består av tre moduler for å utføre disse oppgavene. De første segmenter celle regioner basert på kontrasten mellom fokusert og ufokusert lyse felt bilder og tillater brukeren å definere og visuelt teste segmentering parametere. De andre spor (. Med Blair og Dufresne sin MATLAB gjennomføring av Crocker et al IDL rutine, tilgjengelig på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) og måler celle regioner gjennom tiden; automatisk tildeler linjene, og muliggjør visuell inspeksjon og feilretting. En enkel plotting GUI er inkludert for å spørring encellede egenskaper. Den tredje modulen tilskriver bud fremveksten og divisjon times, og utganger helcelle tidsserier samt deres første og andre gang derivater (som omtalt i ^9). Analysen modulen sender dataene som en space-tekstfil for senere studie i statistisk programvare av valget. Dermed kan pakken brukeren til å trekke høy kvalitet tidsseriedata gjennom et grafisk grensesnitt. Vi har brukt denne metoden til å beregne i sanntid transkripsjon priser i enkelt spirende gjær-celler som en funksjon av cellesyklusen ^9.. Mens moduler er optimalisert for spirende gjær, parametrene eller, om nødvendig, den fritt tilgjengelige koden kan være tilpasset for andre organismer og bilde-typer. Segmentering, sporing, og avstamning oppdrag algoritmer kan være spesifikke for typer bildebehandling tildelt og organismen i spørsmålet. De eksisterende algoritmer kan byttes ut, men likevel beholde det grafiske grensesnittet som gjør det mulig brukervennlig visuell inspeksjon og korrigering av segmentering og sporing feil som alltid tjenestepensjonr med noen algoritme.

Protocol

En. Skaff Fluorescent Mikroskopi Filmer av single gjærceller Økende i en Microfluidic Chamber Inokuler 1 ml medium SC (definerte syntetiske medier med 2% glukose og fullstendige komplement av aminosyrer) med celler fra en fersk voksende plate, og inkuber over natten kultur ~ 16 timer på en valse trommel ved 30 ° C. Forbered kulturen slik at den endelige OD 600nm er ~ 0,1 for tidlig log-fase vekst. Fortynne forrett kultur som trengs og regrow 1 ml i en fersk test tube ytterligere 6-8 t…

Representative Results

En vellykket utført og analysert eksperimentet vil gi stort sett sammenhengende tidsserier for enslige hele celler med realistisk tildelt knopp fremveksten og divisjon ganger. Som et eksempel, utførte vi ovennevnte protokoll med en haploid gjærstamme som uttrykker en integrert kopi av Cerulean fluorescerende protein (CFP) som drives av den konstitutive ADH1-promotoren for å observere hvordan vekst og global ekspresjon kan variere over tid i enkle celler (tabell 4, Y47 ). Vi løp ti…

Discussion

Listen protokollen beskriver en enkel metode for å innhente og analysere fluorescens tidsserier med begrenset erfaring i MicroFluidics eller i programvareutvikling. Det gjør det mulig å få time-lapse fluorescens filmer av single gjærceller, trekke ut relevant celle størrelse og uttrykk målinger, kapellan sporing og avstamning oppdrag, og analysere atferden til hele celler over tid ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig microfluidic kultur-enhet og en allsidig grafisk brukergrensesnitt (GUI). Mens den eksperimen…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit