Förvärva Fluorescens Time-lapse filmer av knoppande jäst och analysera Encelliga Dynamics med transplantat

Summary

Vi presenterar ett enkelt protokoll för att erhålla fluorescensmikroskopiska filmer av växande jästceller, och en GUI-baserad programvara paket för att extrahera encelliga tidsseriedata. Analysen omfattar automatiserad härstamning och division tidstilldelning integreras med visuell inspektion och manuell curation spårade uppgifter.

Abstract

Fluorescens tidsförlopp mikroskopi har blivit ett kraftfullt verktyg i studiet av många biologiska processer vid encelliga nivå. I synnerhet filmer som skildrar den tidsmässiga beroendet av genuttryck ge insikt i dynamiken i dess reglering, men det finns många tekniska utmaningar för att erhålla och analysera fluorescens filmer av enskilda celler. Vi beskriver här ett enkelt protokoll med ett kommersiellt tillgängligt mikrofluidikanordning kultur anordning för att generera sådana uppgifter, och en MATLAB-baserad, grafiskt användargränssnitt (GUI)-baserad programvara för att kvantifiera fluorescens bilder. Programvaran segmenten och spår celler, gör det möjligt för användaren att visuellt komminister fel i uppgifterna, och automatiskt tilldelar härstamning och tider division. Den grafiska analyserar vidare tidsserierna att producera hela celler spår samt deras första och andra derivat tid. Medan programvaran var utformad för S. cerevisiae, bör dess modularitet och flexibilitet gör det möjligt to fungera som en plattform för att studera andra celltyper med några modifikationer.

Introduction

Single-cell analys av genuttryck har främjat vår förståelse av många aspekter av genreglering. Statiska ögonblicksbilder av fluorescerande reporter uttryck med flödescytometri eller mikroskopi ger användbar information om fördelningen av encelliga uttryck, men saknar historia och utvecklingen av tidsseriedata som krävs för att direkt informera dynamiken genuttryck. Fluorescens tidsförlopp mikroskopi utgör ett medel för att erhålla både encelliga mätningar och deras historia. Olika experimentella och analytiska tekniker har utvecklats för att erhålla och kvantifiera filmer av fluorescerande reporter uttryck, därmed förmedla insikter funktioner genreglering (se ¹ för en översikt) såsom cell-till-cell variation ^2,3, bakteriell persister formation ^4, transkription initiering och töjning ^5, transkriptionella spricker ^6,7, cell-cykeln beroendet ^8,9, och ärftlighet ^10. Emellertid OBTaining kvalitet encelliga fluorescens tidsserier innebär stora tekniska utmaningar inom odling ett monoskikt av celler i en kontrollerbar miljö och i high-throughput kvantifiering av de förvärvade fluorescens filmer. Här beskriver vi ett förfarande för att skaffa och analysera fluorescens filmer av S. cerevisiae utan erforderlig erfarenhet cellodlingsanordning tillverkning eller inom mjukvaruutveckling (Figur 1).

Först, detalj vi ett exempel protokoll för att generera fluorescens filmer tidsserier för spirande jäst som uttrycker en eller flera fluorescerande reportrar. Även kundanpassade mikrofluidiska kultur kammare har byggts och framgångsrikt använts tidigare ^11-13, använder vi en kommersiellt tillgänglig mikrofluidikanordning från CellAsic (Hayward, CA). Systemet begränsar celler till monoskikt tillväxt och möjliggör kontinuerlig kontroll av perfusionen miljön. Den mikroskopi protokoll vi presenterar är ett enkelt sätt att få fluorescerENCE filmer av spirande jäst, men något modifierad experimentellt protokoll (en anpassad kultur enhet, alternativa medier förhållanden, osv.), vilket gav liknande fluorescens filmen data för enstaka jästceller kan ersättas.

Därefter skisserar vi en analys av filmer med ett grafiskt användargränssnitt (GUI)-baserad mjukvara i MATLAB (Mathworks, Natick, MA), dubbat GUI för snabb analys av fluorescens Time Series (transplantat), för att extrahera tidsseriedata för enskilda celler. Transplantat har likheter med den mångsidiga, open-source mjukvara Cell-ID ¹⁴ i segmentera och spåra celler och utvinna fluorescens intensitet och geometrisk information. Dock ger transplantat ytterligare viktiga funktioner. Först erbjuder det lätt interaktiv redigering av segmentering och spårning resultat för att verifiera uppgifternas korrekthet, snarare än bara statistiska slussning av utanförliggande region spår efter analys. Dessutom sträcker den analysen till automatically nominerade härstamning och cell-cykel punkter av intresse i spirande jäst. Bestämma när mor och dotter delar för att bilda två självständiga celler regioner är avgörande för att bestämma hela cellen (mor, inklusive alla anslutna knopp) mätningar under hela cellcykeln ^8. Sviten består av tre moduler för att utföra dessa uppgifter. De första segmenten cell regioner bygger på kontrasten mellan fokuserad och ofokuserad ljusfält bilder, och tillåter användaren att definiera och visuellt testa segmentering parametrar. De andra spår (. Använder Blair och Dufresne s MATLAB genomförandet av Crocker et al IDL rutin, finns på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) och mäter cell regioner genom tiden, tilldelar automatiskt härstamningar, och möjliggör visuell inspektion och felkorrigering. En enkel plottning GUI ingår att fråga encelliga egenskaper. Den tredje modulen tillskriver knopp uppkomst och division times, och matar hela celler tidsseriedata samt deras första och andra derivat tid (vilket diskuteras i ^9). Analysen Modulen matar datan som en rymd-textfil för senare studier i statistisk programvara val. Således möjliggör paketet för användaren att extrahera högkvalitativa tidsseriedata genom ett grafiskt gränssnitt. Vi har använt denna metod för att uppskatta realtid transkription klassar i enkla spirande jästceller som en funktion av cellcykeln ^9. Medan de moduler har optimerats för spirande jäst, parametrarna eller, om så är nödvändigt, kan den fritt tillgängliga koden anpassas för andra organismer och bildtyper. Segmentering, tracking, och härstamning tilldelning algoritmer kan vara specifika för olika typer av särskilda imaging och organismen i fråga. De befintliga algoritmer kan ersättas, men ändå behålla det grafiska gränssnittet som tillåter användarvänlig visuell inspektion och korrigering av segmentering och följningsfel som undantagslöst yrkesr med någon algoritm.

Protocol

Ett. Skaffa fluorescensmikroskopi filmer av Single Jäst celler som växer i en Microfluidic avdelningen Inokulera 1 ml SC-medium (syntetiska definierade media med 2% glukos och fullständig komplement av aminosyror) med celler från en nyligen växande platta och inkubera över natten kultur ~ 16 timmar på en berg trumma vid 30 ° C. Förbered kulturen så att den slutliga OD 600nm är ~ 0,1 för tidig log-fas tillväxt. Späd startkulturen som behövs och avkrävdes 1 ml i ett nytt pro…

Representative Results

Ett godkänt resultat och analyserade experiment kommer att ge mestadels kontinuerlig tidsserier för enskilda hela celler med realistiskt tilldelad knopp uppkomst och tider division. Som ett exempel, utförde vi ovanstående protokoll med en haploid jäststam som uttrycker en integrerad kopia av Cerulean fluorescerande protein (GFP) som drivs av den konstitutiva ADH1-promotorn för att observera hur tillväxt och global expression kan variera med tiden i enskilda celler (tabell 4, Y47…

Discussion

Ovanstående protokoll beskriver en enkel metod för att inhämta och analysera fluorescens tidsseriedata med begränsad erfarenhet microfluidicsen eller inom mjukvaruutveckling. Det gör att man kan få tidsförlopp fluorescens filmer av enstaka jästceller, extrahera relevant cellstorlek och mätningar uttryck, komminister spårning och inlämningsuppgifter härstamning, och analysera beteendet hos hela celler över tiden med ett kommersiellt tillgängligt mikrofluidisk kultur-enhet och en mångsidig grafiskt använda…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit