Summary

استعدادا شبه سليمة المعزولة من الفأر الدهليزي الظهارة الحسية للالكهربية وعالية الدقة الميكروسكوب ثنائي الفوتون

Published: June 13, 2013
doi:

Summary

معقد تحليل الدهليزي وظيفة خلايا الشعر عن طريق موقعهم في أعماق أصعب جزء من الجمجمة، والعظم الصدغي الصخري. وقد استخدمت معظم الدراسات خلية الشعر وظيفي حاد خلايا الشعر معزولة. هنا نحن تصف إعداد شبه سليمة من ظهارة الدهليزي الماوس للدراسات المجهر الكهربية واثنين من الفوتون.

Abstract

فهم خلايا الشعر الدهليزي تعمل في ظل ظروف طبيعية، أو كيف الصدمات النفسية، والمرض، والشيخوخة تعطيل هذه الوظيفة هي خطوة حيوية في وضع نهج وقائي و / أو استراتيجيات علاجية جديدة. ومع ذلك، فإن غالبية الدراسات التي بحثت في وظيفة الدهليزي الشاذ لم تكن على المستوى الخلوي ولكنها ركزت في المقام الأول على المقايسات السلوكية من اختلال وظيفي الدهليزي مثل التحليلات مشية والأداء المنعكس الدهليزي العيني. في حين أن هذا العمل قد حقق بيانات قيمة حول ما يحدث عندما تسوء الأمور، واستقاها القليل من المعلومات بشأن الأسباب الكامنة وراء اختلال وظيفي. من الدراسات التي تركز على العمليات الخلوية والتحت خلوية التي تكمن وراء وظيفة الدهليزي، وقد اعتمدت معظم تماما على خلايا الشعر معزولة، خالية من صلاتهم متشابك ودعم بيئة الخلية. ولذلك، فقد كان التحدي التقني الرئيسي الوصول إلى خلايا حساسة بشكل رائع الشعر الدهليزي في الإعداديةaration التي تعطلت الأقل، من الناحية الفسيولوجية. هنا علينا أن نظهر استعدادا شبه سليمة من الفأرة دهليزي ظهارة الحسية التي يحتفظ الصغرى البيئة المحلية بما في ذلك خلية الشعر / المجمعات وارد الأولية.

Introduction

على الرغم من المساهمة الكبيرة للنظام الدهليزي في حياتنا اليومية، وفهم واضح لعمليات مسؤولة عن الانخفاض الملحوظ في وظيفة الدهليزي مع التقدم في السن لا تزال بعيدة المنال. وأحد أسباب هذا النقص في المعرفة هو أن الانخفاض في وظيفة الدهليزي قد وجه الحصر تقريبا تم استكشافه باستخدام المقايسات السلوكية، بما في ذلك المنعكس الدهليزي العيني (VOR)، وهو مؤشر دقيق من وظيفة الدهليزي خارجي، ولكنها توفر رؤى محدودة إلى التغييرات الجوهرية من مكونات . هذا يشكل عائقا رئيسيا في فهمنا لالدهليزي وظيفة خلايا الشعر في الصحة والمرض، أو الشيخوخة.

بينما كانت هناك العديد من الدراسات الفردية خلايا الشعر الدهليزي، وكان أحد أوجه القصور الرئيسية في الاعتماد على التحضيرات خلية الشعر الحادة، حيث يتم إزالة خلايا الشعر والمحطات وارد حتى الكأس من بيئتهم الطبيعية عبر المعالجة الميكانيكية و / أو الأنزيمية. النهج مثل inevitaتعطيل بلاي والمعمارية المصغرة الدقيق بين الخلية الشعر والكأس، والشعر الخلية والخلية الداعمة. مع تطور التحضيرات شبه سليمة 1-5، والماوس معزولة إعداد متاهة وهناك الآن فرصة لدراسة مختلف أشكال الاتصالات متشابك في ظل ظروف أكثر شبها تلك الموجودة في الجسم الحي. في الواقع، ليم وآخرون (2011) وأظهرت فروق كبيرة في تيارات خلية كاملة مسجلة من نوع معزولة تماما أنا خلايا الشعر الدهليزي مقارنة مع تلك التي بقيت جزءا لا يتجزأ من داخل الظهارة العصبية. على وجه التحديد، ويعتقد البوتاسيوم لتتراكم في الفضاء بين الخلايا، بين الخلية الشعر والكأس وارد، ويغير كثيرا شعر استجابة الخلية 7. وهذا النوع من المعلومات سيكون من المستحيل للحصول دون إعداد شبه سليمة من ظهارة الحسية الدهليزي هو موضح هنا. ونحن لشرح إعداد شبه سليمة من الفأرة العرف 3وتظهر نتائج ممثلة تم الحصول عليها من خلية كاملة التصحيح الكهربية، والتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون.

Protocol

1. جماعة من الحيوان وتم الحصول على الفئران من مركز القوارض الأسترالي (ARC؛ بيرث، أستراليا) والذي عقد في جامعة سيدني مرفق الحيوان بوش على الضوء / الظلام دورة 12 ساعة طبيعية مع تخصيب البيئية. وقد وافق جميع التجارب التي وصفها…

Representative Results

الخصائص الكهربية للخلايا الشعر الدهليزي تعتمد على معمارية معقدة في غضون التي تضمهم 7. يبين الشكل 5 أن إعداد ظهارة الدهليزي شبه سليمة ويمكن استخدامها للتمييز بين النوع الأول خلايا الشعر (الشكل 5A)، نوع خلايا الشعر الثاني (الشكل 5B)، والك?…

Discussion

وقد تلقى الآليات الكامنة وراء شعورنا التوازن اهتماما محدودا بالمقارنة مع النظم الحسية الأخرى، مثل نظم البصرية والسمعية. من الدراسات التي حققت تغييرات في وظيفة الدهليزي أو التوازن، وركزت معظم بشأن التدابير السلوكية بما في ذلك المنعكس الدهليزي العيني، مع معرفة …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل موديل قديم غارنيت ورودني وليامز التذكاري منحة مشروع المؤسسة إلى R. ليم ومعسكر AJ.

Materials

REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

References

  1. Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
  2. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
  3. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
  4. Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
  5. Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
  6. Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
  7. Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
  8. Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
  9. Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
  10. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
  12. Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
  13. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  14. Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).

Play Video

Cite This Article
Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

View Video