Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie
Summary
Analyse der vestibulären Haarzellen Funktion wird durch ihre Lage tief innerhalb der schwierigste Teil des Schädels, der Felsenbein kompliziert. Die meisten funktionalen Haarzellen Studien haben akut isolierten Haarzellen verwendet. Hier beschreiben wir eine semi-intakten Herstellung von Maus vestibulären Epithel für elektrophysiologische und Zwei-Photonen-Mikroskopie Studien.
Abstract
Verstehen vestibulären Haarzellen funktionieren unter normalen Bedingungen, oder wie Trauma, Krankheit und Altern stören diese Funktion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von präventiven Ansätze und / oder neue therapeutische Strategien. Allerdings haben die meisten Studien, die abnormale vestibulären Funktion nicht auf der zellulären Ebene gewesen, aber konzentrierte sich hauptsächlich auf Verhaltens-Assays Vestibularisausfall wie Ganganalysen und vestibulookulären Reflex Leistung. Während diese Arbeit wertvolle Daten über das, was passiert, wenn etwas schief geht ergeben hat, ist nur wenig Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Funktionsstörung aufgelesen. Von den Studien, dass auf der zellulären und subzellulären Prozessen, die Vestibularfunktion zugrunde zu konzentrieren, haben die meisten auf akut isolierten Haarzellen, ohne ihre synaptischen Verbindungen und Unterstützung Zellumgebung verlassen. Daher ist eine große technische Herausforderung gewesen Zugriff auf die außerordentlich empfindlich vestibulären Haarzellen in einem prepTrennung, die am wenigsten gestört, physiologisch. Hier zeigen wir eine semi-intakten Präparat der Maus vestibulären Sinnesepithel, die die lokale Mikroumgebung behält einschließlich Haarzellen / primären afferenten Komplexe.
Introduction
Trotz der bedeutenden Beitrag des vestibulären Systems zu unserem täglichen Leben, bleiben ein klares Verständnis der Prozesse, die für die beobachtete Abnahme in vestibulären Funktion mit dem Alter schwer zu fassen. Ein Grund für diesen Mangel an Wissen ist, dass Rückgang der vestibulären Funktion hat fast ausschließlich erforscht mit Verhaltensstörungen Assays, einschließlich der vestibulookulären Reflex (VOR), eine genaue Anzeige der extrinsische vestibulären Funktion, sondern bietet nur begrenzten Einblick in die Veränderungen der intrinsischen Komponenten . Dies ist ein wesentliches Hindernis für unser Verständnis der vestibulären Haarzellen Funktion in Gesundheit, Krankheit oder Alterung.
Zwar gibt es viele Studien einzelner vestibulären Haarzellen wurde ein entscheidender Nachteil war die Abhängigkeit von akuten Haarzellen Zubereitungen, in denen Haarzellen und sogar Kelch afferenten Terminals aus ihrer normalen Umgebung über mechanische und / oder enzymatische Behandlung entfernt werden. Solche Ansätze zwangsBly stören das empfindliche Mikroarchitektur zwischen Haarzellen und Kelch und Haarzellen und Stützzellen. Mit der Entwicklung von semi-intakten Präparate 1-5 und einem isolierten Maus Labyrinth Zubereitung 6, gibt es jetzt eine Möglichkeit, die verschiedenen Formen der synaptischen Kommunikation unter den Bedingungen, die stärker die in vivo ähneln studieren. Tatsächlich zeigte Lim et al. (2011) deutliche Unterschiede in ganzen Zellen Ströme von akut isoliert Typ I aufgezeichnet vestibulären Haarzellen zu denen, die eingebettet in die Neuroepithel blieb verglichen. Insbesondere wird angenommen, dass Kalium in den interzellulären Raum ansammeln, zwischen den Haarzellen und Kelch afferenten und signifikant verändern Haar-Zell-Antwort 7. Diese Art von Informationen wäre unmöglich, ohne die semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel hier beschriebenen zu erhalten. Wir zeigen die semi-intakten Präparat der Maus crista 3Und zeigen repräsentative Ergebnisse von whole-cell Patch Elektrophysiologie erhalten und Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die zugrunde liegenden Mechanismen unseren Gleichgewichtssinn haben begrenzte Aufmerksamkeit im Vergleich mit anderen sensorischen Systemen erhalten, z. B. die visuelle und auditive Systeme. Von den Studien, die Veränderungen in der vestibulären oder Balance-Funktion untersucht haben, haben die meisten auf verhaltensorientierten Maßnahmen einschließlich der vestibulookulären Reflex konzentriert, mit unvollständigen Kenntnis der fundamentalen Bausteine der Balance-den vestibulären Haarzellen sich. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Garnett Passe und Rodney Williams Memorial Foundation Projektstipendium R. Lim und AJ Camp zur Verfügung gestellt.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
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