Изолированные Semi-нетронутыми Подготовка Мышь вестибулярного сенсорного эпителия электрофизиологии и высоким разрешением двухфотонной микроскопии
Summary
Анализ вестибулярной функции волосковых клеток осложняется их расположения в глубине трудная часть черепа, височной кости височной кости. Большинство функциональных исследований волосковых клеток использовали остро изолированных клеток волос. Здесь мы опишем полу-нетронутыми подготовку вестибулярного эпителия мыши для электрофизиологических и двухфотонного микроскопических исследований.
Abstract
Понимание вестибулярных волосковых клеток функционировать в нормальных условиях, или как травмы, болезни и старение нарушить эту функцию является жизненно важным шагом в развитии профилактических подходов и / или новых терапевтических стратегий. Тем не менее, большинство исследований, глядя на ненормального вестибулярной функции не были на клеточном уровне, но сосредоточены главным образом на анализе поведенческих вестибулярной дисфункции, такие как исследования походки и вестибулоокулярный рефлекс производительности. Хотя эта работа дала ценные данные о том, что происходит, когда что-то идет не так, мало информации о почерпнуть основные причины дисфункции. Из исследований, которые сосредоточены на клеточных и субклеточных процессов, лежащих в основе функционирования вестибулярного аппарата, большинство из них полагаются на остро изолированы волосковые клетки, лишенные своих синаптических связей и поддержки клеточного окружения. Таким образом, основной технической проблемой был доступ к чрезвычайно чувствительны вестибулярных волосковых клеток в подготовительнуютовка, в наименьшей степени нарушен, физиологически. Здесь мы показываем, полу-нетронутыми подготовке мыши вестибулярного сенсорного эпителия, который сохраняет местных микро-среды, включая клетки волос / первичных афферентных комплексов.
Introduction
Несмотря на значительный вклад вестибулярной системы в нашей повседневной жизни, четкое понимание процессов, ответственных за наблюдаемое снижение вестибулярной функции с возрастом остаются неизвестными. Одна из причин этого отсутствие знаний является то, что снижение вестибулярной функции почти исключительно были изучать с помощью поведенческого анализа, в том числе вестибулоокулярный рефлекс (VOR), точным индикатором внешней вестибулярной функции, но предоставляет ограниченную способность проникновения в суть изменений собственных компонентов . Это является основным препятствием для нашего понимания вестибулярной функции волосковых клеток в области здравоохранения, болезни, или старения.
В то время было много исследований индивидуальных вестибулярных волосковых клеток, одним из основных недостатков была опора на острые волосы клеточных препаратов, где волосковые клетки и даже чашечки афферентных терминалов удаляются из своей нормальной среде с помощью механических и / или ферментативной обработки. Такие подходы неизбежностиБлай нарушить тонкое микроархитектуры между волосковых клеток и чашечки, и волосковых клеток и поддерживающих клетки. С развитием полу-нетронутыми препараты 1-5 и изолированном препарате лабиринт мыши 6, в настоящее время возможность изучить различные формы синаптические связи в условиях, которые больше напоминают те, в естественных условиях. Действительно, Лим и др.. (2011) показали заметные различия в целом токи ячейки записывается с остро изолированный типа я вестибулярных волосковых клеток по сравнению с теми, что остались встроенные в нейроэпителии. В частности, калий, как полагают, накапливаются в межклеточном пространстве между волосковых клеток и чашечки афферентных и значительно изменить волосы клеточный ответ 7. Этот тип информации было бы невозможно получить без полу-нетронутыми подготовку вестибулярного сенсорного эпителия описаны здесь. Мы демонстрируем полу-нетронутыми подготовке мыши Криста 3, И показать представитель результаты, полученные из целых клеток патч электрофизиологии и двухфотонного Кальций изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Механизмы, лежащие в основе нашего чувства равновесия получили мало внимания по сравнению с другими сенсорными системами, например, зрительной и слуховой систем. Из исследований, изучавших изменения в вестибулярной или баланса белого, большинство из них сосредоточено на поведен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этой работы была предоставлена Гарнетт Passe и Родни Уильямс Мемориальный фонд грантового проекта Р. Лим и AJ лагерь.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
