En isolerad Semi-intakt Beredning av Mouse Vestibular sensoriska epitelet för elektrofysiologi och Högupplöst Två-foton mikroskopi
Summary
Analys av vestibulär hår cellernas funktion kompliceras av deras läge djupt inne den svåraste delen av skallen, den STENAKTIG temporal ben. Mest funktionella hårcell studier har använt akut isolerade hårceller. Här beskriver vi en semi-intakt beredning av mus vestibulära epitel för elektrofysiologiska och två-photon mikroskopi studier.
Abstract
Förstå vestibulära hårcellerna fungerar under normala förhållanden, eller hur trauma, sjukdom och åldrande störa denna funktion är ett viktigt steg i utvecklingen av förebyggande insatser och / eller nya terapeutiska strategier. Dock har de flesta studier som ser onormala vestibulära funktionen inte varit på cellnivå, men främst inriktad på beteendemässiga analyser av vestibulär dysfunktion såsom gångsvårigheter analyser och vestibulo-okulär reflex prestanda. Även detta arbete har gett värdefulla data om vad som händer när saker går fel, är lite information som samlats om de bakomliggande orsakerna till dysfunktion. Av de studier som fokuserar på de cellulära och subcellulära processer som ligger bakom vestibulär funktion, har mest förlitat sig på akut isolerade hårceller, saknar deras synapsförbindelser och stödjande celler miljö. Därför har en stor teknisk utmaning har tillgång till de utsökt känsliga vestibulära hårcellerna i ett prepdelser som är minst störd, fysiologiskt. Här visar vi en semi-intakt beredning av musen vestibulära sensoriska epitelet som behåller den lokala mikro-miljö, inklusive hårcell / primära afferenta komplex.
Introduction
Trots den betydande bidrag i det vestibulära systemet till vår vardag, en tydlig förståelse av de processer som är ansvariga för den observerade nedgången i vestibulär funktion med åldern förblir svårfångade. En orsak till denna brist på kunskap är att nedgången i vestibulär funktion har nästan uteslutande undersökts med hjälp av beteendemässiga analyser, inklusive vestibulo-okulära reflexen (VOR), en exakt indikator för yttre vestibulär funktion, men ger begränsad insikt i de förändringar av inneboende komponenter . Detta är ett stort hinder för vår förståelse av vestibulära hår cellernas funktion i hälsa, sjukdom, eller åldrande.
Även om det har gjorts många studier av enskilda vestibular hårceller, har en stor brist varit beroende av akuta förberedelser hårceller, där hårceller och även foderblad afferenta terminaler avlägsnas från sin normala miljö via mekanisk och / eller enzymatisk behandling. Sådana metoder inevitanolikt störa den känsliga mikroarkitekturen mellan hårceller och blomfoder, och hår cell och stödjande celler. Med utvecklingen av semi-intakta preparat 1-5, och en isolerad mus labyrint förberedelse 6, finns det nu en möjlighet att studera olika former av synaptisk kommunikation under förhållanden som mer liknar dem som in vivo. Det framgick Lim et al. (2011) markerade skillnader i hela celler strömmar inspelade från akut isolerad typ I vestibulära hårcellerna jämfört med dem som var inbäddad i neuroepitelet. Närmare bestämt är kalium tänkt att ackumuleras i det intercellulära utrymmet, mellan håret cellen och blomfoder afferent, och signifikant förändra svaret hårcell 7. Denna typ av information skulle vara omöjligt att få utan semi-intakt preparat i vestibulära sensoriska epitelet beskrivs här. Vi visar semi-intakt beredning av musen Crista 3, Och visar representativa resultat från hel-cell patch elektrofysiologi, och två-photon kalcium avbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanismerna bakom vårt balanssinne har fått begränsad uppmärksamhet i jämförelse med andra sensoriska system, t.ex. visuella och auditiva system. Av de studier som har undersökt förändringar i vestibulär eller balans funktion, har mest fokuserat på beteendemässiga åtgärder inklusive vestibulo-okulär reflex, med ofullständiga kunskaper i de grundläggande byggstenarna i balans-vestibulära hårcellerna själva. De studier som har koncentrerat sig på hårcellerna har nästan undantagslöst gjort…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen för detta arbete lämnades av en Garnett Passe och Rodney Williams Memorial Foundation Projektbidrag till R. Lim och AJ Camp.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
- Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
- Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. , (2009).
- Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. , (2009).
- Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. , (2010).
- Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. , (2010).
- Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
- Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
- Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
- Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
- Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
