Undersøgelse af<em> Drosophila</em> Larver luftrør Terminal Cells ved lysmikroskopi
Summary
Her præsenterer vi en metode til lysmikroskopi analyse af trakeale terminale celler<em> Drosophila</em> Larver. Denne metode giver mulighed for hurtig undersøgelse af branche-og lumen morfologi i hele dyr, og ville være nyttigt for analyse af de enkelte mutanter eller skærme for mutationer, der påvirker terminal celle udvikling.
Abstract
Celleform er kritisk for cellefunktion. Men på trods af betydningen af cellemorfologi, er lidt om, hvordan de enkelte celler genererer specifikke former. Drosophila trakeale terminal cellerne er blevet en kraftfuld genetisk model til at identificere og belyse de roller gener, der kræves for at generere cellulære morfologi. Terminale celler er en del af et forgrenet rørformet net, trakeal system, der fungerer til at levere ilt til interne væv. Terminale celler er en fremragende model til undersøgelse spørgsmål celle form som de besidder to forskellige cellulære arkitekturer. Først terminale celler har en omfattende forgrenet morfologi, der ligner komplekse neuroner, for det andet er terminale celle filialer dannet som tynde rør og indeholder en membranbundet intracellulær lumen. Kvantitativ analyse af terminal celle filial nummer, brancheorganisation og individuel gren form, der kan bruges til at give oplysninger om den rolle, specifikke genetiske mechnismer i frembringelsen af et forgrenet celle. Analyse af rør-dannelse i disse celler kan afsløre konserverede mekanismer tubulogenesis fælles for andre rørformede net, såsom hvirveldyr vaskulatur. Her beskriver vi teknikker, der kan bruges til hurtigt at fastsætte, billede og analysere både forgrenede mønstre og rør dannelse i terminal celler i Drosophila larver. Disse teknikker kan anvendes til at analysere terminale celler i vildtype-og mutant dyr, eller genetiske mosaikker. På grund af den høje effektivitet i denne protokol, er det også velegnet til genetiske, RNAi-baserede eller narkotika skærme i Drosophila luftrør system.
Introduction
Celleform er kritisk for funktionen af de enkelte celler i en organisme, samt celler, der fungerer som en del af et væv eller organ. Vi bruger Drosophila trakeale terminal celler, en komponent af insekt åndedrætsorganerne, til at undersøge de molekylære mekanismer, der deltager i styring af to bevarede typer af cellulære morfologi: branching og rør dannelse (lumenogenesis). Terminal celler er placeret på spidsen af et netværk af forgrenede rør, der fungerer til at levere ilt til interne væv 1 og har en omfattende forgrenet morfologi, der er afhængig af en FGF signalvejen, der styres af lokale iltindhold inden målvæv 2. Terminal celle grene er tynde rør, med et gasfyldte subcellulære lumen løber gennem hver gren. De forskellige cellulære arkitekturer for terminal-celler, sammen med den lethed, hvormed genetisk analyse kan udføres i Drosophila, gør disse celler en fremragende model feller efterforske mekanismer cellulær udvækst forgrening, og intracellulære rørdannelse. Terminal celler har vist en nyttig model til at forstå nogle af de signalveje, der fører til forgrenede celledifferentiering, udvækst, og modning 2-4. Bruger dette system fordomsfri, har frem genetiske skærme til celle morfogenese mutanter blevet udført, giver indsigt i mekanismer, der styrer cellens form 5,6. For eksempel har disse skærme afsløret, at en specifik RabGAP er nødvendig for cytoskelet polaritet og vesikel handel i lumen dannelse og positionering 7, at integrin-medieret adhæsion er nødvendig for filial stabilitet 8, og at epitelial PAR-polaritet proteiner regulerer polariseret membran kræves handel for både forgrening og lumen dannelse 9.. Andre undersøgelser i terminal celler har vist, at asymmetriske actin ophobning og mikrotubulus organisation er nødvendig for celleforlængelse og lumenogenesis <sup> 10. Således forskelligartede, konserverede cellebiologiske mekanismer bidrager til terminal celle morfogenese.
Her beskriver vi en metode til hurtigt at fastsætte intakt tredje stadie Drosophila larver til analyse af terminal celle forgrening og lumen dannelse. Denne protokol kan også udføres på både første og andet stadium dyr. Nøglen til denne teknik er evnen til at visualisere terminale celler, der er genetisk mærket med fluorescerende protein ekspression direkte gennem larve kutikula af intakte dyr. Da denne procedure ikke kræver nogen post-fiksering manipulationer, såsom antistoffarvning, at observere cellerne, er det velegnet til high throughput analyse, herunder genetisk eller narkotika screening. Fluorescerende protein ekspression afslører strukturen af de cytoplasmatisk-fyldte grene. Rørdannelse kan overvåges parallelt med lysfelt-mikroskopi til at identificere det gasfyldte hulrum, som står i kontrast til den omgivende væske-filled væv.
Inkluderet i denne protokol er den metode til at generere genetiske mosaikker er baseret på MARCM systemet 11 til at producere homozygote mutant terminal celler mærket med fluorescerende proteiner i ellers umærkede dyr. Dette er nødvendigt, fordi terminal celler kun udarbejde deres komplekse strukturer relativt sent i udviklingen, genetiske mosaikker tillader bypass af gen krav i andre væv tidligere i udviklingen. . For at generere MARCM kloner er luftrøret mærkes ved hjælp af trakeal-specifikke driver forpustet (BTL) 12. Beskrevet her er protokollen for Drosophila X-kromosomet, for andre kromosomer, kan en tilsvarende procedure anvendes, med genetiske reagenser hensigtsmæssigt at kromosomet bliver undersøgt. Her er luftrøret mærket ved ekspression af et cytoplasmatisk lokaliseret GFP, men proceduren virker lige godt med ekspression af andre fluorescerende proteiner, såsom DsRed.
Derudover har vi inkluderet en metode til at kvantificere forgrenede mønstre og lumen dannelse i terminal celler, baseret på metoder udviklet til at karakterisere neuronale gren mønstre 13. Denne form for kvantitative data kan være kritisk i kræsne den præcise rolle af gener i forgrening eller lumenogenesis proces, samt giver mulighed for direkte sammenligninger mellem forskellige mutanter 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varmen fiksering teknikken beskrevet her er en hurtig og praktisk værktøj til billedbehandling Drosophila larver trakeale terminal celler. Her bruger vi denne teknik til at undersøge forgrening og lumen mønster af vildtypeceller. Trakeal celler, der udtrykker GFP, drevet af luftrør specifik promotor forpustet, kan nemt visualiseres gennem larve kutikula efter varmefiksering. De specifikke forgrening mønstre af individuelle terminal celler, såvel som de af luftfyldte hulrum, kan være hurtigt vis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gillian Stanfield for kommentarer til manuskriptet. TAJ er støttet af University of Utah Genetik Training Grant T32-GM007464 fra NIH NIGMS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
