の検討<em>ショウジョウバエ</em光学顕微鏡で>幼虫気管ターミナルセル
Summary
ここでは、気管内端末細胞の光学顕微鏡分析のための方法を提案する<em>ショウジョウバエ</em>幼虫。この方法は、動物全体の支店および内腔の形態の迅速な検査を可能にし、個々の変異体または端末細胞の発達に影響を与える変異の画面の分析に有用であろう。
Abstract
セル形状は、細胞の機能にとって重要である。しかし、細胞の形態の重要性にもかかわらず、少し特定の形状を生成する方法を個々の細胞について知られている。 ショウジョウバエ気管末端細胞は細胞の形態を生成するために必要な遺伝子の役割を識別し、解明するための強力な遺伝モデルとなっている。端末細胞は、分岐筒ネットワークの構成要素は、内部組織に酸素を供給するように機能することを気管系である。ターミナル細胞は、彼らは二つの異なる携帯電話のアーキテクチャを持っているとして、セル形状の問題を調査するための優れたモデルです。まず、端末細胞は、複雑なニューロンと同様の精巧な分枝状の形態を有し、第二、端末のセル枝は細い管として形成され、膜結合型細胞内腔を含んでいる。端末セル枝番号、分岐組織と個々のブランチ形状の定量分析を、特定の遺伝子メカの役割に関する情報を提供するために使用することができる分枝状細胞の意思でanisms。これらの細胞における管形成の分析は、例えば脊椎動物の脈管構造のような他の管状ネットワークに共通の細管形成の保存メカニズムを明らかにすることができる。ここでは、迅速に、画像を固定するために使用することができる技術を記述し、 ショウジョウバエの幼虫内でも分枝パターンと端子細胞における管形成を分析する。これらの技術は、野生型および変異動物細胞内の端末、または遺伝子モザイクを分析するために使用することができる。このため、プロトコルの高効率化のため、それはまた、遺伝よく、RNAiのベース、またはショウジョウバエ気管系における薬物の画面に適している。
Introduction
セル形状は、組織または器官の一部として、個々の生体内の細胞、ならびに細胞機能の機能にとって重要である。分岐管形成および（lumenogenesis）：我々は、細胞の形態の2つの保存種類の制御に関与する分子機構を調べるためにショウジョウバエ気管末端細胞、昆虫呼吸器システムの構成要素を使用する。端子細胞は、機能が内部組織1に酸素を提供し、標的組織内のローカル2酸素レベルによって制御されるFGFシグナル経路に依存する精巧な分枝状形態を有するようにすること分岐状のチューブネットワークの先端に配置されている。ターミナル細胞の枝には、各ブランチを介して実行してガスを充填した細胞内腔と、細い管である。遺伝子解析がショウジョウバエにおいて実行される際の容易性と共に端末細胞の別個のセルラーアーキテクチャでは、これらの細胞の優れたモデルfを行うまたは、細胞の伸長のメカニズムを調査して分岐し、細胞内の管形成。端末細胞は、分枝状細胞分化、伸長、および成熟2-4に至るシグナル伝達経路のいくつかを理解するのに有用なモデルを証明している。公正このシステムを用いて、細胞形態形成変異体のための順遺伝子スクリーニングは、細胞形状5,6を制御するメカニズムについての洞察を得行われている。インテグリン媒介接着は分岐安定8に必要であること、、例えば、これらの画面には、特定のRabGAPが管腔形成とポジショニング7における細胞骨格の極性と小胞輸送に必要とされることが明らかになっていると、その上皮PAR-極性タンパク質が必要な偏光膜輸送を規制分岐と管腔形成9の両方に。端末細胞における他の研究は、非対称アクチンの蓄積と微小管の組織細胞の伸長およびlumenogenesisに必要であることが示されている<s> 10まで。このように、多様な、保存された細胞生物学的メカニズムは、端末細胞形態形成に貢献しています。
ここでは、急速に、端末セル分岐と管腔形成の分析にそのままサード齢ショウジョウバエの幼虫を修正する方法について説明します。このプロトコルはまた、第1及び第2齢動物で行うことができる。この手法の鍵は、遺伝的に直接、そのまま動物の幼虫のクチクラを通じて蛍光タンパク質発現によって標識されているターミナル細胞を可視化する機能です。この手順は、このような抗体染色などの任意の定着後の操作は、細胞を観察する必要がないので、よく遺伝子または薬物スクリーニングを含む、ハイスループット分析に適している。蛍光タンパク質の発現は、細胞質で満たされた分岐の構造を明らかにする。管形成は、並列周囲を埋める流体と対照ガス充填管腔を識別する明視野顕微鏡を使用して監視することができる編組織。
このプロトコルに含まれているそれ以外の場合は未標識動物における蛍光タンパク質で標識されたホモ接合変異体端末細胞を産生するためのMARCMシステム11に基づいて、遺伝的モザイクを生成する方法である。端末細胞は、比較的遅い開発におけるそれらの複雑な構造を詳しく説明するため、これは必要であり、遺伝的モザイクは、以前の開発における他の組織における遺伝子要件のバイパスを可能にする。 。MARCMクローンを生成するには、気管がここで説明息気管固有のドライバ（BTL）12を用いて標識していると、 ショウジョウバエの X染色体のためのプロトコルであり、他の染色体のために、同様の手順である染色体に適した遺伝試薬で、使用することができます検討した。ここでは、気管細胞質局在化GFPの発現によってラベル付けされますが、手順はそのようなDsRedのような他の蛍光タンパク質の発現でも同様に動作します。
さらに、我々はニューロンの分岐パターン13を特徴付けるために開発された方法に基づいて、端末細胞の分岐パターンと管腔形成を定量化する方法が含まれている。定量的なこの種のデータは、目の肥えた正確な分岐またはlumenogenesis過程における遺伝子の役割だけでなく、さまざまな変異体9との間の直接比較を可能に重要なことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明した熱定着方式は、撮像ショウジョウバエの幼虫の気管末端細胞の迅速かつ便利なツールである。ここでは、野生型細胞の分岐とルーメンパターンを調べるためにこのテクニックを使用しています。 息気管特異的プロモーターによって駆動GFPを発現する気管細胞は熱固定後の幼虫のクチクラを通じて簡単に可視化することができる。特定の分岐個別端末のセルのパタ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿上のコメントにジリアンスタンフィールドに感謝します。 TAJはNIHのNIGMSからユタ遺伝トレーニンググラントT32-GM007464大学によってサポートされています。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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