Examen de<em> Drosophila</em> Larvaires cellules terminales trachéales par microscopie optique
Summary
Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse de microscopie optique des cellules trachéales terminaux en<em> Drosophila</em> Larves. Cette méthode permet d'examen rapide de la branche et de la morphologie de la lumière dans des animaux entiers et serait utile pour l'analyse des mutants individuels ou écrans pour les mutations affectant le développement des cellules terminal.
Abstract
la forme des cellules est essentiel pour la fonction cellulaire. Cependant, malgré l'importance de la morphologie des cellules, on en sait peu sur la façon dont les cellules individuelles génèrent des formes spécifiques. Cellules terminales trachéales drosophile sont devenus un modèle génétique puissant pour identifier et élucider les rôles des gènes nécessaires pour générer des morphologies cellulaires. des cellules de bornes sont un composant d'un réseau tubulaire ramifiée, le système trachéal qui fonctionne pour fournir de l'oxygène aux tissus internes. cellules terminales sont un excellent modèle pour étudier les questions de la forme des cellules car ils possèdent deux architectures cellulaires distincts. Tout d'abord, les cellules terminales ont une morphologie ramifiée complexe, semblable à des neurones complexes, deuxièmement, branches de cellules terminales sont formées comme des tubes minces et contiennent une lumière intracellulaire membranaire. L'analyse quantitative de nombre de succursales de la cellule terminale, l'organisation de la branche et la forme de la branche individuelle, peut être utilisé pour fournir des informations sur le rôle de mech génétique spécifiquenismes dans la fabrication d'une cellule ramifiée. L'analyse de la formation du tube dans ces cellules peuvent révéler des mécanismes conservées de tubulogenèse communs à d'autres réseaux tubulaires, tels que le système vasculaire vertébré. Nous décrivons ici les techniques qui peuvent être utilisés pour fixer rapidement, l'image et analyser à la fois les modèles de branchement et la formation de tubes dans les cellules de terminaux au sein de larves de drosophile. Ces techniques peuvent être utilisées pour analyser les cellules terminales chez les animaux de type sauvage et mutant, ou des mosaïques génétiques. En raison de la grande efficacité de ce protocole, il est également bien adapté pour les écrans de drogue dans le système trachéal Drosophila génétique, basées sur l'ARNi, ou.
Introduction
la forme des cellules est essentiel pour la fonction de cellules individuelles au sein d'un organisme, ainsi que des cellules qui fonctionnent comme une partie d'un tissu ou d'organe. Nous utilisons des cellules terminales trachée chez la drosophile, une composante du système respiratoire des insectes, pour étudier les mécanismes moléculaires qui participent à contrôler deux types conservées de la morphologie cellulaire: L'éclaircie et la formation du tube (lumenogenesis). cellules de terminaux sont situés à l'extrémité d'un réseau de tubes ramifiés qui sert à fournir de l'oxygène aux tissus internes 1 et ont une morphologie ramifiée complexe qui dépend d'une voie de signalisation FGF qui est contrôlée par les niveaux d'oxygène dans les tissus locaux cibles 2. branches de la cellule de terminaux sont des tubes minces, avec un gaz remplies de lumière sub-cellulaires fonctionnant par chaque branche. Les architectures cellulaires distincts de cellules terminales, ainsi que la facilité avec laquelle l'analyse génétique peut être réalisée chez la drosophile, font de ces cellules un excellent modèle fou mécanismes d'excroissance cellulaire enquête, la ramification et la formation du tube intracellulaire. cellules terminales sont avérés un modèle utile pour comprendre certaines des voies de signalisation conduisant à la différenciation cellulaire ramifiée, excroissance, et la maturation 2-4. Grâce à ce système impartial, écrans avant génétiques pour mutants de morphogenèse cellulaires ont été réalisées, ce qui donne un aperçu des mécanismes de contrôle de la forme des cellules 5,6. Par exemple, ces écrans ont révélé qu'un RabGAP spécifique est nécessaire pour la polarité du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans la formation de lumière et de positionnement 7; que l'adhésion médiée par l'intégrine est nécessaire pour la stabilité de la branche 8, et que les protéines PAR-polarité épithéliale réguler le trafic membranaire polarisée requis à la fois pour la ramification et formation de lumière 9. D'autres études dans des cellules de terminaux ont montré que l'accumulation d'actine asymétrique et l'organisation des microtubules est nécessaire à l'élongation cellulaire et lumenogenesis <sup> 10. Ainsi, la diversité des mécanismes biologiques, conservées par les cellules contribuent à la morphogenèse des cellules en phase terminale.
Ici, nous décrivons une méthode pour fixer rapidement intact troisième stade larves de drosophile pour l'analyse des cellules ramification de terminal et formation de lumière. Ce protocole peut aussi être réalisée à la fois premier et deuxième animaux de stade. La clé de cette technique est la possibilité de visualiser les cellules terminales qui sont génétiquement marquées par l'expression de la protéine fluorescente directement à travers la cuticule des larves d'animaux intacts. Depuis que cette procédure ne nécessite pas de manipulations post-fixation, tels que la coloration d'anticorps, d'observer les cellules, il est bien adapté à l'analyse à haut débit, y compris le dépistage génétique ou de drogue. Expression de la protéine fluorescente révèle la structure des branches cytoplasme remplis. la formation du tube peut être contrôlée en parallèle en utilisant la microscopie à champ clair d'identifier la lumière remplie de gaz, ce qui contraste avec le fluide environnant-filltissus éd.
Inclus dans ce protocole est la méthode pour générer des mosaïques génétiques basés sur le système marcm 11, pour produire des cellules mutantes homozygotes terminaux étiquetés avec des protéines fluorescentes dans les animaux autrement non étiquetés. Cela est nécessaire, car les cellules terminales seulement élaborer leurs structures complexes relativement tard dans le développement; mosaïques génétiques permettent de contournement des exigences de gènes dans d'autres tissus plus tôt dans le développement. . Pour générer des clones marcm, de la trachée sont étiquetés en utilisant le pilote spécifique à bout de souffle trachéal (BTL) 12 décrit ici est le protocole pour le chromosome X chez la drosophile, car d'autres chromosomes, une procédure similaire peut être utilisée, avec des réactifs génétique approprié au chromosome étant examiné. Ici, la trachée sont marquées par l'expression d'une GFP localisée dans le cytoplasme, mais la procédure fonctionne aussi bien avec l'expression d'autres protéines fluorescentes, comme DsRed.
En outre, nous avons inclus une méthode pour quantifier les schémas de branchement et la formation de lumière dans les cellules terminales, basée sur des méthodes développées pour déterminer les caractéristiques de la branche neuronales 13. Ce genre de données quantitatives peut être critique pour discerner le rôle exact de gènes dans le processus de branchement ou lumenogenesis, ainsi que de permettre des comparaisons directes entre les différents mutants 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique de fixation à la chaleur décrit ici est un outil rapide et pratique pour drosophile cellules terminales trachéales larvaires imagerie. Ici, nous utilisons cette technique pour examiner le branchement et le modèle lumen des cellules de type sauvage. Cellules trachéales exprimant la GFP, dirigé par le promoteur spécifique trachéale à bout de souffle, peuvent être facilement visualisées à travers la cuticule des larves après la fixation de la chaleur. Les schémas de branchement …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Gillian Stanfield de commentaires sur le manuscrit. TAJ est soutenu par l'Université de l'Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 de NIGMS NIH.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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