Prüfung der<em> Drosophila</em> Larven Tracheal Terminal-Cells durch Lichtmikroskopie
Summary
Hier präsentieren wir eine Methode für die Lichtmikroskopie Analyse der Luftröhre Terminal Zellen in<em> Drosophila</em> Larven. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Prüfung der Branche und Lumen Morphologie in ganzen Tieren und wäre nützlich für die Analyse der einzelnen Mutanten oder Bildschirme für Mutationen, die Terminal-Zell-Entwicklung.
Abstract
Zellform ist entscheidend für die Zellfunktion. Doch trotz der Bedeutung der Morphologie der Zellen, ist wenig darüber, wie einzelne Zellen erzeugen spezifische Formen bekannt. Drosophila tracheal Terminal Zellen haben sich zu einem mächtigen genetisches Modell zu identifizieren und erläutern die Rolle von Genen benötigt zur Erzeugung von zellulären Morphologie. Terminal-Zellen sind eine Komponente eines verzweigten röhrenförmigen Netzes, die Tracheen, dass Sauerstoff zu liefern inneren Geweben dient. Terminal-Zellen sind ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Fragen der Zelle Form, wie sie zwei unterschiedliche zelluläre Architekturen besitzen. Zuerst müssen Klemme Zellen eine aufwendige verzweigten Morphologie ähnlich komplexen Neuronen, zweitens Endzelle Zweige als dünne Rohre ausgebildet und enthalten eine membrangebundene intrazellulären Lumen. Quantitative Analyse von Zell-Terminal Zweig-Nummer, Branchenverband und einzelne Zweig Form kann verwendet werden, um Informationen über die Rolle von spezifischen genetischen mech liefernnismen in der Herstellung eines verzweigten Zelle. Analyse tube formation in diesen Zellen zeigen konservierten Mechanismen Tubulogenese gemeinsam mit anderen rohrförmigen Netzwerke wie das Wirbeltier Gefäßsystem. Wir beschreiben Techniken, die verwendet werden, um schnell zu beheben, Bild werden kann und zu analysieren und sowohl Verzweigungsmustern tube formation in Terminal Zellen in Drosophila-Larven. Diese Techniken können verwendet werden, um Zellen Terminal in Wildtyp-und mutierten Tiere, oder genetische Mosaike zu analysieren. Aufgrund der hohen Effizienz des Protokolls ist es auch gut für genetische, RNAi-oder Drogen-Bildschirme in der Drosophila Tracheensystem geeignet.
Introduction
Zellform ist entscheidend für die Funktion der einzelnen Zellen in einem Organismus, sowie Zellen, die als Teil eines Gewebes oder Organs. Wir verwenden Drosophila tracheal Terminal-Zellen, eine Komponente des Insekts Atmungsorgane, um die molekularen Mechanismen, die bei der Kontrolle zwei konservierte Arten von zellulären Morphologie teilnehmen zu untersuchen: Verzweigung und tube formation (lumenogenesis). Terminal-Zellen an den Spitzen eines Netzes von verzweigten Rohren angeordnet ist, daß Funktionen, um Sauerstoff zu inneren Gewebe 1 zu liefern und eine aufwendige verzweigten Morphologie, die auf einer FGF Signalweg, der durch lokale Sauerstoffgehalt im Zielgewebe 2 gesteuert abhängt. Terminal-Zelle Zweige sind dünne Röhren, mit einem gasgefüllten subzellulären Lumen, die durch jeden Zweig. Die unterschiedlichen zellulären Architekturen Terminal Zellen zusammen mit der Leichtigkeit, mit der genetischen Analyse in Drosophila durchgeführt werden kann, um diese Zellen ein ausgezeichnetes Modell foder die Untersuchung der zellulären Mechanismen Auswuchs, Verzweigung und intrazellulären tube formation. Terminal-Zellen haben ein nützliches Modell für das Verständnis einige der Signalwege, die zu verzweigten Zelldifferenzierung, Auswuchs und Reifung 2-4 bewiesen. Mit diesem System unvoreingenommene, haben uns genetischen Screens für Zellmorphogenese Mutanten durchgeführt, wodurch Einblicke in Mechanismen, die Zellform 5,6. Zum Beispiel haben diese Bildschirme enthüllt, dass ein bestimmtes RabGAP für Zytoskelett Polarität und Vesikeltransport in Lumenbildung und Positionierung 7 erforderlich ist; dass Integrin-vermittelte Adhäsion für Zweig Stabilität 8 gefordert wird, und dass die epithelialen PAR-Proteine regulieren Polarität polarisierter Membran Menschenhandel erforderlich sowohl für Verzweigung und Lumenbildung 9. Andere Studien in Terminal Zellen haben gezeigt, dass asymmetrische Aktin Akkumulation und Organisation der Mikrotubuli für die Zell-Dehnung und lumenogenesis erforderlich <sbis> 10. So tragen diverse, konservierten zellbiologischen Mechanismen der Klemme Zellmorphogenese.
Hier beschreiben wir ein Verfahren, um schnell beheben intakt dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zur Analyse der Endzelle Verzweigung und Lumenbildung. Dieses Protokoll kann auch auf beide ersten und zweiten Larvenstadium Tieren durchgeführt. Der Schlüssel zu dieser Technik ist die Fähigkeit, Zellen, die gentechnisch Terminal durch fluoreszierende Protein-Expression direkt durch die Larvencuticula von intakten Tieren gekennzeichnet visualisieren. Da dieses Verfahren benötigt keine Postfixierung Manipulationen, wie z. B. Antikörper-Färbung, um die Zellen zu beobachten, ist es gut für das Hochdurchsatz-Analyse geeignet, einschließlich genetischer oder Wirkstoff-Screening. Fluorescent Protein-Expression zeigt die Struktur der zytoplasmatisch gefüllten Ästen. Rohr-Bildung kann in parallel mit Hellfeld den gasgefüllten Lumen, die mit der umgebenden Flüssigkeit zu füllen kontrastiert identifizieren überwacht werdened Gewebe.
Inbegriffen in diesem Protokoll ist das Verfahren zur Erzeugung von genetischen Mosaiken an der MARCM System 11, um homozygote Mutante Terminal Zellen mit fluoreszierenden Proteinen in ansonsten unmarkierten Tieren markierten Produkten. Dies ist notwendig, da nur Zellen Terminal erarbeiten ihren komplexen Strukturen relativ spät in der Entwicklung; genetischen Mosaiken ermöglichen Bypass Gen Anforderungen in anderen Geweben früher in der Entwicklung. . Um MARCM Klone erzeugen, Luftröhre sind beschriftet mit der Tracheal-spezifische Treiber atemlos (BTL) 12 Beschrieben ist hier das Protokoll für die Drosophila X-Chromosom, bei anderen Chromosomen, ein ähnliches Verfahren verwendet, mit genetischen Reagenzien werden, die dem Chromosom ist untersucht. Hier werden Luftröhre durch Expression einer cytoplasmatisch lokalisierten GFP-markierten, aber das Verfahren funktioniert genauso gut mit der Expression anderer fluoreszierende Proteine wie DsRed.
Darüber hinaus haben wir ein Verfahren zur Verzweigung Muster und Lumenbildung im Terminal Zellen quantifiziert, basierend auf Methoden zur Charakterisierung neuronalen Verzweigungsmustern 13 entwickelt enthalten. Diese Art von quantitativen Daten kann kritisch sein in der anspruchsvollen genaue Rolle von Genen bei der Verzweigung oder lumenogenesis Prozess, sowie die Möglichkeit für direkte Vergleiche zwischen verschiedenen Mutanten 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Wärmefixierung hier beschriebene Technik ist eine schnelle und bequemes Werkzeug für Imaging Drosophila Larven tracheal Terminal Zellen. Hier verwenden wir diese Technik, um die Verzweigung und Lumen Muster von Wildtyp-Zellen zu untersuchen. Tracheal-Zellen, die GFP durch die Luftröhre Promotor atemlos angetrieben, können leicht sichtbar durch die Larvencuticula nach Wärmefixierung. Die spezifischen Verzweigungsmustern einzelnen Terminal-Zellen, sowie die von den mit Luft gefüllten Hohlraum, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Gillian Stanfield für Kommentare zum Manuskript. TAJ wird von der University of Utah Genetics Ausbildungsförderung T32-GM007464 von NIH NIGMS unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
