Undersökning av<em> Drosophila</em> Larvernas Trakealtuber Terminal Celler med ljusmikroskop
Summary
Här presenterar vi en metod för ljusmikroskop analys av luftstrupen terminal celler i<em> Drosophila</em> Larver. Denna metod möjliggör en snabb undersökning av grenen och lumen morfologi i hela djur och skulle vara användbar för analys av enskilda mutanter eller skärmar för mutationer som påverkar utvecklingen terminal cell.
Abstract
Cell form är kritisk för cellfunktion. Trots vikten av cellens morfologi, är lite känt om hur enskilda celler skapar specifika former. Drosophila luftrör terminal celler har blivit en kraftfull genetisk modell för att identifiera och belysa de roller gener som krävs för att generera cellulära morfologier. Terminal-celler är en del av en grenad rörformigt nät, trakeal system som fungerar för att tillföra syre till inre vävnader. Terminal celler är en utmärkt modell för att undersöka frågor av cellform som de besitter två distinkta cellulära arkitekturer. Först, terminal-celler har en utarbetad förgrenad morfologi, liknande komplexa neuroner, för det andra är terminala cell grenar formade som tunna rör och innehåller en membranbundna intracellulära lumen. Kvantitativ analys av terminal cell gren nummer, branschorganisation och individuell gren form, kan användas för att ge information om vilken roll specifika genetiska mechnismer i skapandet av en förgrenad cell. Analys av rörbildning i dessa celler kan avslöja konserverade mekanismer för tubulogenesis gemensamma för andra rörformiga nät, såsom ryggradsdjuret vaskulaturen. Här beskriver vi metoder som kan användas för att snabbt fixa, bild, och analysera både förgrening mönster och rörbildning i terminal celler i Drosophila larver. Dessa tekniker kan användas för att analysera terminala celler i vildtyp och mutanta djur, eller genetiska mosaiker. På grund av den höga effektiviteten i detta protokoll, är det också väl lämpad för genetisk, RNAi-baserade, eller skärmar drog i Drosophila trakeal systemet.
Introduction
Cell form är avgörande för funktionen hos individuella celler inom en organism, liksom även celler som fungerar som en del av en vävnad eller ett organ. Vi använder Drosophila luftrör terminal celler, en komponent av insekten andningsorganen, för att undersöka de molekylära mekanismer som deltar i styrning av två bevarade typer av cellulär morfologi: förgrening och rörbildning (lumenogenesis). Terminal celler är placerade på spetsarna av ett nätverk av förgrenade rör som fungerar för att leverera syre till inre vävnader 1 och har en utarbetad grenade morfologi som beror på en FGF signalväg som styrs av lokala syrenivåer inom målvävnader 2. Terminal cell grenar är tunna rör, med en gasfylld subcellulära lumen som löper genom varje gren. De distinkta cellulära arkitekturer av terminal-celler, tillsammans med den lätthet med vilken genetisk analys kan utföras i Drosophila, gör dessa celler en utmärkt modell feller undersöka mekanismer för cellulär utväxt, förgrening, och intracellulär rörbildning. Terminal celler har visat sig vara en användbar modell för att förstå några av de signalvägar som leder till förgrenad cell differentiering, utväxt, och mognad 2-4. Med detta system objektiv, har framåt genetiska skärmar för mutanter cell morphogenesis utförts, vilket ger insikter i mekanismer som styr cellens form 5,6. Till exempel har dessa skärmar avslöjade att en specifik RabGAP krävs för cytoskelettala polaritet och vesikel handel med lumen bildning och positionering 7, att integrin-medierad adhesion krävs för gren stabilitet 8, och att epiteliala PAR-polaritet proteinerna reglerar polariserad membran trafficking krävs för både förgrening och lumen formation 9. Andra studier i terminal celler har visat att asymmetrisk aktin anhopning och mikrotubuli organisation krävs för cellförlängning och lumenogenesis <supp> 10. Således, diverse, konserverade cellbiologiska mekanismer bidrar till terminal cell morfogenes.
Här beskriver vi en metod för att snabbt fastställa intakt tredje instar Drosophila larver för analys av terminal cell förgrening och lumen formation. Detta protokoll kan också utföras på både första och andra instar djur. Nyckeln till denna teknik är förmågan att visualisera terminala celler som är genetiskt märkta av fluorescerande protein expression direkt genom larver nagelband av intakta djur. Eftersom detta förfarande inte kräver några post-fixering manipulationer, såsom antikroppar färgning, för att observera cellerna, det är väl lämpad för hög genomströmning analys, inklusive genetisk eller drog screening. Fluorescerande proteinuttryck avslöjar strukturen för cytoplasmatiskt-fyllda grenar. Tube formation kan övervakas parallellt med användning brightfield mikroskop för att hitta den gasfyllda lumen, som kontrasterar med den omgivande fluiden-filled vävnader.
Inkluderat i detta protokoll är metoden för att generera genetiska mosaiker baserade på MARCM systemet 11, för att producera homozygota mutanta terminala celler märkta med fluorescerande proteiner i annars omärkta djur. Detta är nödvändigt, eftersom terminal celler endast utarbeta sina komplexa strukturer relativt sent i utvecklingen, genetiska mosaiker möjliggör förbikoppling av genen krav i andra vävnader tidigare i utvecklingen. . Att generera marcm kloner, är luftstrupe märkta med trakeal-drivrutin andfådd (BTL) 12 Beskrivs här är protokollet för Drosophila X-kromosom, för andra kromosomer, kan ett liknande förfarande användas, med genetiska reagens lämpligt till kromosomen är undersökas. Här används luftstrupe märkt genom uttryck av en cytoplasmatiskt lokaliserad GFP, men förfarandet fungerar lika bra med uttrycket av andra fluorescerande proteiner, såsom DsRed.
Dessutom har vi inkluderat en metod för att kvantifiera förgrening mönster och lumen bildning i terminal celler, bygger på metoder som utvecklats för att karakterisera neuronala gren mönster 13. Denna typ av kvantitativa data kan vara avgörande för kräsna den exakta rollen av gener i förgreningen eller lumenogenesis process, samt möjliggör direkta jämförelser mellan olika mutanter 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Värmen fixering teknik som beskrivs här är en snabb och praktiskt verktyg för att avbilda Drosophila larver luftrör terminal celler. Här använder vi denna teknik för att undersöka förgrening och lumen mönster av vildtypceller. Luftrör celler som uttrycker GFP, driven av luftrör promotor andfådd, kan lätt visualiseras genom larver nagelbanden efter värme fixering. De särskilda förgrening mönster av enskilda terminal celler, liksom de av luftfyllda hålrum, kan vara snabbt visualiseras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Gillian Stanfield för kommentarer på manuskriptet. TAJ stöds av University of Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 från NIH NIGMS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
