מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Summary

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Abstract

תכונות מכאניות של תאים ומטריצה ​​תאית (ECM) ממלאות תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל בידול בתאי גזע, היווצרות גידול, וריפוי פצעים. שינויים בקשיחות של תאים וECM הם לעתים קרובות סימנים של שינויים בפיזיולוגיה של תא או מחלות ברקמות. לפיכך, תא קשיחות היא מדד להערכת המצב של תרביות תאים. בין מספר רב של שיטות שיושמו על מנת למדוד את הנוקשות של תאים ורקמות, מיקרו כניסה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מספקת דרך למדוד את הנוקשות של תאי חיים באופן מהימן. שיטה זו כבר מיושמת באופן נרחב כדי לאפיין את הנוקשות בקנה מידה מייקר עבור מגוון רחב של חומרים, החל ממשטחי מתכת לרקמות רכות ותאים ביולוגיים. העיקרון הבסיסי של שיטה זו הוא לכניסה לתא עם קצה AFM של גיאומטריה נבחרה ולמדוד את הכח המופעל מהכיפוף של שלוחה AFM. התאמת עקומת כוח הכניסה למצב הרץl לגיאומטרית הקצה המקביל יכול לתת מדידות כמותיות של חומר קשיח. מסמך זה מדגים את ההליך כדי לאפיין את הנוקשות של תאי חיים באמצעות AFM. צעדים מרכזיים, כולל תהליך של כיול AFM, רכישת כוח עקומה, וניתוח נתונים באמצעות שגרת MATLAB הם הפגינו. מגבלות של שיטה זו הם דנו גם.

Introduction

תכונות מכאניות, במיוחד נוקשות, של תאים בודדים ומטריצות תאי המקיפות (ECM) הן קריטיות לתהליכים ביולוגיים רבים, כולל צמיחת תאים, תנועתיות, חלוקה, התמיינות, והומאוסטזיס רקמות. ¹ זה כבר הוכיח כי נוקשות מכאני תא נקבעת בעיקר על ידי cytoskeleton, במיוחד את הרשתות של אקטין וסיבי ביניים וחלבונים אחרים הקשורים בהם. ² תוצאות של בדיקות מכאניות ברשתות במבחנה של אקטין וסיבי ביניים מראות כי את המכניקה של התאים תלויה במידה רבה את מבנה cytoskeletal והמתח טרום ב שלד התא. ^3-5 נוקשות של תאי חיים אז הוא נחשב למדד כדי להעריך את מבנה cytoskeletal ^{6, 7} פעילות שרירן ורב תהליכים תאיים אחרים. יותר מכך, שינויים בתכונות מכאניות של תאים מצויים גם לעתים קרובות להיות associ מקרובated עם תנאי מחלה שונים, כגון היווצרות גרורה סרטניים ^8-10 ניטור הנוקשות מכאנית של תאי חיים ולכן יכולות לספק דרך חדשנית לניטור פיזיולוגיה תא;. לזהות ולאבחן מחלות ^8;. וכדי להעריך את היעילות של טיפולים תרופתיים ^{11 , 12}

שיטות מרובות, כולל microrheology חלקיק מעקב, ^13-16 cytometry פיתול מגנטית, ¹⁷ שאיפת micropipette ^18,19 וmicroindentation ^20-22 פותחו כדי למדוד את האלסטיות של תאים. microrheology מעקב אחר החלקיקים משרטטת את תנודות התרמיות של חלקיקים או ניאון submicron הזריקו לתוך תאים או סמני fiducial בתוך שלד תא התא. ²³ תכונות אלסטיות וצמיגות של תאים מחושבות מהתקות החלקיקים נמדדו באמצעות משפט תנודות-פיזור. ^14,23 שיטה זו מאפשרת מדידות בו זמניות של מקומיתכונות מכאניות עם רזולוציה מרחבית גבוהה במקומות שונים בתא. עם זאת, הזרקת חלקיקי ניאון לתאים עלולה לגרום לשינויים בתפקוד תא, מבנה שלד תא, ומכאן מכניקה הסלולרי. שיטת שאיפת micropipette חלה לחץ שלילי בmicropipette בקוטר הנע בין 1 ל -5 מיקרומטר למצוץ חתיכה קטנה של קרום תא לתוך פיפטה. תא נוקשות מחושבת מהלחץ השלילי מיושם ועיוות קרום תא. ^-18 שיטה זו, עם זאת, אינו יכולה לזהות את ההתפלגות הטרוגנית של נוקשות על פני התא. cytometry פיתול המגנטית (MTC) חלה שדה מגנטי כדי ליצור מומנט בחרוזים פאראמגנטיים סופר מחובר לקרום התא. סלולרי ¹⁷ נוקשות נגזרה בשיטה זו ממערכת היחסים בין המומנט מיושם ועיוות הפיתול של קרום התא. זה קשה לשלוט על המיקום של חרוזים מגנטיים בשיטת MTC, וזה גם challenging לאפיין את העיוות מתפתלת עם רזולוציה גבוהה. Microindentation חל indenter עם גיאומטריה מוגדרת היטב לאגרוף לתוך התא. כוח indenting והכניסה וכתוצאה מכך תאים לעתים קרובות לעקוב חיזוי של מודל הרץ. moduli של יאנג של תאים ניתן לחשב את עקומות כוח ההזחה על ידי התאמתן למודל הרץ. שיטה זו כבר מיושמת באופן נרחב כדי לבחון את התכונות מכאניות של רקמות ותאים, למרות המגבלות שלה, כגון חוסר ודאות בקביעת קשר נקודה, תחולתו של מודל הרץ, ואת הפוטנציאל לפגיעה פיזית בתאים. בין התקנים רבים לmicroindentaion ^20, מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) הוא זמין באופן מסחרי וכבר מיושם באופן נרחב לאפיון תכונות מכאניות של תאי חיים ורקמות ^21,24-27.

מסמך זה מדגים את ההליך של שימוש מקלט MFP3D-Bio AFM לאפיין מכניקה סלולרי. AFM לא עלly מספק טופוגרפיה ברזולוציה גבוהה של תאים, אלא גם כבר מיושם באופן נרחב כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאים ורקמות. העיקרון של כניסת AFM מודגם באיור 1. שלוחה AFM גישות תא מכמה מיקרומטרים הנ"ל; יוצרת קשר עם התא; כניסות הסלולריים, כך שסטיית שלוחה מגיעה לנקודת סט שנבחרה מראש, ומתרחקת מהתא. במהלך תהליך זה סטיית שלוחה נרשמת כפונקציה של מיקומו, כפי שמוצגת באיור 1. לפני יצירת קשר עם התא, שלוחה נעה במדיום ללא כל סטייה נראית לעין. כאשר indenting בתא, מתכופפת שלוחה ועליות אותות הסטייה. את cantilevers הוא מודל כקורה אלסטיות, כך שהסטייה שלהם היא פרופורציונלית לכח המופעל על התא. על ידי הגדרת סטיית שלוחה המרבית, את הגודל המרבי של כוח המופעל על המדגם מוגבל, כדי למנוע דamage לתאים. החלק של עקומת כוח מהנקודה לנקודה B באיור 1 ג, שבו כניסות קצה לתוך התא, הוא מתאימים למודל הרץ כדי לחלץ את נוקשות התא.

איור 1. איור של microindentation ופרשנות של עקומת כוח AFM. הפנל העליון מראה את התנועה של שלוחה AFM מונעת על ידי סורק piezo. המיקום האנכי של שלוחה ושלוחת z סטיית האות D הוא רשם במהלך התהליך. שלוחה מתחילה מנקודה, כמה מיקרומטרים מעל לתא. בעת שהתקרב לתא, δ כניסת המדגם נשאר אפס עד שהוא מגיע לנקודה ב ', שבו הקצה בא במגע עם התאים. הקואורדינטות של נקודת B בעלילה הן ערכים קריטייםלניתוח נתונים, מסומן על ידי (z _0, ד _0>). מ-B ל-C, את כניסות שלוחה לתוך התא עד שסטיית שלוחה מגיעה לנקודה שנקבעה, אשר מוגדרת להיות היחס בין כוח המרבי indenting ממוקד ומעיין שלוחה המתמיד. ברגע שהאות מגיעה לסטייה מהערך המרבי המוגדר מראש, שלוחה לאחר מכן נסוג מתא לנקודת D, שבו לעתים קרובות להיות משך כלפי מטה בשל הידבקות קצה מדגם, מתנתקת מהתא וחוזר למיקומו הראשוני בדואר. הפנל הימני מדגים את הקשר בין הכניסה וz המוקלט ואות ד. בפנל השמאלי התחתון היא עלילה של עקומת נציג כוח, כניסה המרבית של שלוחה, שקבועות הקפיץ נמדדה להיות 0.07N / מ ', מוגדר להיות 17 ננומטר, כך שהכח המרבי indenting להחיל מדגם הוא 1.2 NN. מקומות מפתח במהלך הכניסה מסומנים.

Protocol

1. לכייל קבוע הקפיץ של שלוחה טען שלוחה לAFM פי הוראות היצרן. יש צורך לנקות את בעל שלוחה עם אתנול לפני כל ניסויים. זה יעזור לצמצם זיהום חיידקים לתרבות במהלך מדידות AFM. לכייל InvOLS (רגישות מנוף אופטי…

Representative Results

איור 2a מציג שלוש עקומות כוח מייצגות שנלקחו מfibroblasts 3T3 תרבית על משטח פלסטיק, ג'ל polyacrylamide של moduli 3,000 אבא של יאנג ו17,000 אבא, בהתאמה. לאחר זיהוי בזהירות את הנקודות המגע בעקומות, כוח indenting כפונקציה של עיוות תא הוא להתוות איור 2b. תחת כוח בסדר גודל קטן יותר מא?…

Discussion

יש שיטת כניסת AFM יתרונות לאפיין תכונות מכאניות של תאי חיים. אם כי פחות רגיש מאשר cytometry המגנטית הפיתול ופינצטה אופטית, שיכול למדוד את הכוחות ברמת piconewton ^32, AFM יכול לזהות כוח התנגדות מדוגמאות הנעות בין עשרות Pico-ניוטון למאות ננו ניוטון, דומות לטווח של כוח ש יכול להיות …

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO