Эта статья демонстрирует протокол для характеристики механических свойств живых клеток с помощью микроиндентирования с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).
Механические свойства клеток и внеклеточного матрикса (ECM) играют важную роль во многих биологических процессах, включая дифференцировку стволовых клеток, образование опухолей, и заживление ран. Изменение жесткости клеток и ECM часто являются признаками изменения в физиологии клеток или заболеваний в тканях. Таким образом, жесткость элемент является индексом для оценки состояния клеточных культур. Среди множества методов, применяемых для измерения жесткость клеток и тканей, микро-отступа использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) обеспечивает возможность надежного измерения жесткость живых клеток. Этот способ широко применяется для описания микро-масштабе жесткости для различных материалов, начиная с металлических поверхностей мягкой биологической ткани и клетки. Основной принцип этого метода является создание отступа ячейки с иглой АСМ выбранной геометрии и измерения приложенной силы от изгиба кантилевера АСМ. Установка силового отступы кривой в режим Hertzл для соответствующей геометрии наконечника может дать количественные измерения жесткости материала. Эта статья демонстрирует процедуру для характеристики жесткости живых клетках с помощью АСМ. Ключевые шаги в том числе процесс калибровки АСМ, сила-кривой приобретения, а также анализ данных с использованием обычного MATLAB демонстрируются. Ограничения этого метода также обсуждаются.
Механические свойства, особенно жесткости отдельных клеток и окружающей их внеклеточного матрикса (ECM) являются критическими для многих биологических процессов, в том числе рост клеток, подвижность, деление, дифференцировку и тканевого гомеостаза. 1 Было показано, что клетки механическую жесткость в основном определяется цитоскелета, особенно сетей актина и промежуточных филаментов и других белков, связанных с ними. 2 Результаты механических испытаний на сетях в пробирке актина и промежуточных филаментов предполагают, что клетки механика во многом зависит от структуры цитоскелета и предварительного напряжения в цитоскелета. 3-5 Жесткость живых клеток затем рассматривается в качестве индекса для оценки структуры цитоскелета, 6, 7 активность миозина и многих других клеточных процессов. Более того, изменения в клеточной механические свойства также часто оказывается тесно свяated с различными условиями заболеваний, таких как образование опухолей и метастазов 8-10 мониторинга механической жесткости живые клетки, следовательно, обеспечить новый способ контроля клеточной физиологии;. для обнаружения и диагностики заболеваний 8;. а также для оценки эффективности медикаментозного лечения 11 , 12
Несколько методов, включая частицы отслеживания микрореология, 13-16 магнитный цитометрии скручивание, 17 микропипетки стремление 18,19 и микроиндентирования 20-22 были разработаны для измерения эластичности клеток. Микрореология отслеживания частиц прослеживает тепловых колебаний либо флуоресцентные частицы субмикронного вводили в клетки или координатных меток внутри клетки цитоскелета. +23 Упругих и вязких свойств клеток рассчитывается из измеренного смещения частиц использованием ФДТ. 14,23 Этот метод позволяет одновременных измерений местныхмеханических свойств с высоким пространственным разрешением в разных местах в клетке. Тем не менее, инъекционное флуоресцентные частицы в клетки может привести к изменению клеточной функции, структуры цитоскелета, и, следовательно, клетки механики. Метод микропипетки пронизывает отрицательного давления в микропипетки с диаметром в диапазоне от 1 до 5 мкм, чтобы сосать небольшой кусок клеточную мембрану в пипетку. Сотовые жесткость рассчитывают из прикладной отрицательное давление и клеточные мембраны деформации. 18 Этот метод, однако, не может обнаружить неоднородное распределение жесткость по всей клетке. Магнитные цитометрии скручивание (ВТС) применяется магнитное поле для создания крутящего момента на супер шарики парамагнитный прикреплен к клеточной мембране. 17 сотовый жесткости происходит в этом методе из соотношения между приложенным крутящий момент и крутящий деформации клеточной мембраны. Это трудно контролировать расположение магнитных шариков в методе МТС, и это также challengiнг охарактеризовать деформация кручения с высоким разрешением. Микроиндентирования относится индентора с четко определенными геометрии пробить в клетку. Отступов силы и в результате углубление в клетках часто следуют предсказания модели Герца. Модуль Юнга клеток, может быть рассчитана по силе отступа кривые путем установки их в герцах модели. Этот способ широко применяется для проверки механических свойств тканей и клеток, несмотря на его ограничения, такие как неопределенность в точке контакта определение, применимость модели Герца, а также возможность физически повредить клетки. Среди многих устройствах для microindentaion 20, атомно-силовой микроскоп (АСМ) является коммерчески доступной и широко применяется для характеристики механических свойств живых клетках и тканях 21,24-27.
Эта статья демонстрирует порядок использования Asylum MFP3D-Bio AFM охарактеризовать клетку механики. AFM не налы обеспечивает высокое разрешение топографию элементов, но и широко применяется для характеристики механических свойств клеток ткани. Принцип отступа АСМ показано на рисунке 1. АСМ кантилевера приближается клетку от нескольких микрометров выше; вступает в контакт с клеткой; отступы ячейки таким образом, чтобы отклонение кантилевера достигает заданной уставки, и отрывается от клетки. Во время этого процесса изгиба кантилевера записывается в виде функции его расположения, как показано на рисунке 1. , Прежде чем связаться с клеткой, кантилевера движется в среде без видимых отклонений. Когда отступа на клетку, кантилевер изгибам и увеличивает отклонение сигнала. Кантилеверов смоделированы как упругих стержней так, чтобы их отклонение пропорционально силе, приложенной к ячейке. Установив максимальный прогиб кантилевера, максимальная величина силы, приложенной к образцу ограничено, чтобы избежать гAmage к клеткам. Часть силовой кривой из точки В в точку С на рисунке 1, где кончик отступы в клетку, не благонадежен для модели Герца, чтобы извлечь клетки жесткость.
Рисунок 1. Иллюстрация AFM микроиндентирования и интерпретация кривой усилия. Верхней панели показано движение кантилевера АСМ обусловлен сканер пьезо. Вертикальное расположение консольные г и изгиба кантилевера сигнал г записывается в ходе процесса. Консольные начинается от точки, в несколько микрометров выше клетку. При приближении к клетке, δ образец отступа остается равным нулю, пока не достигнет точки В, где кончик входит в контакт с клеткой. Координаты точки B в сюжете критические значениядля анализа данных, обозначаемых (Z 0, D 0>). От В к С, кантилевер отступы в клетку до изгиба кантилевера не достигает заданного значения, которое установлено, что соотношение между целевой максимальный отступа силы и жесткости кантилевера. После отклонения сигнала достигает заданного максимального значения, консольные затем удаляется из клетки к точке D, где она часто вырваться вниз под зонд-образец адгезия, отделяется от клетки и возвращается на прежнее место при Е. На правой панели показана взаимосвязь между углублением и записанного г и г сигнала. В левой нижней панели представляет собой график кривой, силы, максимальный отступ консольные, из которых пружины измеряется быть 0.07N / м, установлен на уровне 17 нм так, чтобы максимальное отступов силы, приложенной к образец 1,2 NN. Ключевые места во время отступа будут отмечены.
Метод АСМ углубление имеет преимущества, чтобы охарактеризовать механические свойства живых клеток. Хотя и менее чувствительны, чем магнитные цитометрии скручивания и оптический пинцет, который может измерить силы на уровне piconewton 32, АСМ может обнаружить силы сопротивления из о?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят доктора Пола Janmey в Университете Пенсильвании за предоставление клеточные линии, используемые в работе. КЯ также признать JF Байфилд и Эван Андерсон за их проницательный обсуждения методов АСМ.