불활성 가스 제트를 사용하여 붙음 세포의 Permeabilization
Summary
이 프로토콜은 불활성 가스 제트를 이용한 부착 세포의 임시 permeabilization위한 방법을 설명한다. 이 방법은 세포막을 방해하는 기계적 힘의 이용에 의한 부착 성 포유 동물 세포에 유전 물질과 생체 분자의 전달을 용이하게한다.
Abstract
다양한 세포 형질 전환 기술이 존재하고 이러한 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다 바이러스, 화학, 기계. 이 프로토콜은 시간적으로 세포 내로 일반적으로 비 투과성 거대 분자의 전달을 용이하게 할 수있는 불활성 가스 제트를 사용하여 접착 세포를 투과하는 기계적 방법을 설명한다. 우리는이 기술의 미세 임시 형성의 결과로, 부착 세포의 원형질막에 전단력을 부여하여 작동 믿는다. 이러한 기공이 생성되면, 세포는 유전 물질 및 기타 생체 분자 투과성이다. 관련된 기계적 힘은 기판에서 영구적으로 손상 또는 분리 세포의 위험을 실행 않습니다. 기술이 효과가 불활성 기체 역학의 좁은 범위, 따라서이있다. 불활성 가스 제트는 헬라, HEK293 인간의 복부 대동맥 내피 세포를 포함한 다양한 자기편 세포 라인을 permeabilizing에 효율적으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 P에 적합한우리가 미래의 임상 응용 프로그램에서 잠재적으로 연구에 사용될 수있다 표시, 생체 내에서 증명하고있다으로 관내에는 양쪽 모두에서 부착 세포의 ermeabilization. 또한 가치있는 연구 도구가 될 증명할 수있는, 공간적으로 제한적인 방법으로 세포를 permeabilizing의 장점이 있습니다.
Introduction
생물 의약의 발전과 세포 역학의 이해, 세포로 생체 분자의 전달은 많은 연구 분야 및 의료 치료에 중요한되고있다. 다른 기술은 세포막을 통해 세포의 세포질에 외래 분자를 도입하기 위해 개발되었다. 바이러스, 화학 또는 기계적 방법 : 이들은 일반적으로 분류 될 수있다. 바이러스 성 기술은 바이러스 벡터를 사용하여 RNA 및 DNA로 유전 물질을 형질있다. 바이러스 성 기술은 그러나 그들은 면역 및 염증 반응 2에 대한 가능성을 가지고 할, 특정 세포 라인에 높은 효율을 가지고하는 경향이있다. 일반 화학 형질 전환 방법은 인산 칼슘 3, 세균 외독소 4 리포 펙 (5)과 강수량 (가) 있습니다. 이러한 기법은 효과적 일 수있다, 그러나, 특정 문제는 세포 독성 및 비 특이성으로 발생한다. 또한, 칼슘 인산염 같은 기법전자 강수량은 거의 일차 전지 6에서 최대 70 %에 있지만, 특정 세포주에 형질 전환 효율이 발견되었습니다. 증가하는 연구 노력은 특히 임상과 DNA의 기능에 대한 연구를위한 다양한 치료를 설계하는 경우, 일차 전지에 투입되는 등이 주입니다.
기계적 자극을 통해 세포막의 일시적인 중단이 세포로 외래 분자를 도입하기위한 대안이다. 기술은 다음을 포함한다 : 분자 (7)의 미세 주입, 막 8,9을 방해하는 전기장을 사용하여 일렉트로, sonoporation와 결합 입자를 촬영 "유전자 총"에 의해 설명되는 것과 같이 세포막 10-12, 입자 충격을 방해하기 위해 초음파를 사용하여 셀 (13) 내로의 유전자, 및 더 최근에, 시간적으로 포유 동물 세포에게 14,15 투과 표시되었습니다 유체 전단 응력의 적용. 하지만 정비공알 방법은 앞서 언급 한 몇 가지 문제를 방지, 그들은 일반적으로 낮은 효율성과 매우 복잡하고 전문적인 설정 함께 제공됩니다. 대기압 글로우 방전 토치 (APGD-t)는 표면 기능화 및 생체 외 (16)에 부착 세포를 분리의 초기 목표로 맥길로 개발되었다. Serendipitously, 사용되는 라이브 / 죽은 얼룩은 어떻게 든 permeabilizing 에이전트가 첨가하지 않고 세포에 의해 촬영되고 있음을 발견했다. 또한,이 단지 토치 경로와 일치하는 일이 우물의 제한 지역에서 발생한 것 같았다. APGD-T의 permeabilization 기능의 조사는 계속 제어 연구에서, 그것은 여자가없는 플라즈마의 캐리어 불활성 가스 제트는 또한 세포를 투과 할 수 있었다 것으로 나타났습니다. 이것은 플라즈마 제트에 의해 생성 된 반응 종 일시적 막의 기능을 손상 초기 가설 모순 및 제안 단순히 기계적 것을칼의 힘은 세포 permeabilization의 원인이하기에 충분했다. 여기에서 연구를 시도하고 정량화 permeabilization의 불활성 가스 제트의 효율성뿐만 아니라 형질 전환 기능 (16)에 의해 모양의 특징을 우리의 실험실에서 계속했다.
이러한 연구를 통해, 그 미세 기공은 세포막에 팩트 형태로 수행하는 것이 발견되었으며, 이러한 기공은 약 5 초 이내에 15 봉인하는 경향이있다. 우리는 병아리 태아의 융모 막 생체 외 및 생체 내에서 기술의 유틸리티를 증명하고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
불활성 가스 제트 permeabilization은 자기편 세포의 형질 전환을위한 유용한 기술이다. 그것은 잠재적으로 유해한 화학 물질이나 바이러스 벡터에 대한 필요성을 없애 기계적 힘의 용도로 세포에 생물 분자를 전송하는 기능을 제공한다. 이 기술은 잠재적으로 연구자와 임상의에게 정확하게 세포를 형질 효율적이고 비교적 간단한 방법을 제공 할 수 있습니다. permeabilization의 선택은 또한 연구자는 여…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) : 저자는 다음과 같은 자금 조달에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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