Permeabilisierung der anhaftenden Zellen mit einem Inertgas Jet
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die vorübergehende Permeabilisierung der adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl. Diese Technik erleichtert die Übertragung von genetischem Material und Biomolekülen in adhärente Säugetierzellen durch die Verwendung von mechanischen Kräften, um die Plasmamembran zu stören.
Abstract
Verschiedene Zell Transfektion Techniken existieren und diese können bis zu drei Kategorien unterteilt werden: Virus-, chemische und mechanische. Dieses Protokoll beschreibt ein mechanisches Verfahren zur zeitlich permeabilisiert adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl, der die Übertragung von in der Regel nicht durchlässig Makromolekülen in Zellen erleichtern können. Wir glauben, dass diese Technik durch Verleihen von Scherkräften an der Plasmamembran von adhärenten Zellen, was die temporäre Bildung von Mikroporen. Wenn diese Poren erzeugt werden, werden die Zellen dann durchlässig genetische Material und anderen Biomolekülen. Die beteiligten mechanischen Kräfte nicht Gefahr laufen, dauerhaft beschädigen oder Ablösen Zellen von ihrem Substrat. Es ist daher ein enger Bereich des inerten Gasdynamik in denen die Technik effektiv ist. Eine inerte Gasstrahl hat bei permeabilisierenden verschiedenen adhärenten Zelllinien, einschließlich HeLa, HEK293 und menschlichen Bauchaorta-Endothelzellen effizient erwiesen. Dieses Protokoll für die p angemessenermeabilization von adhärenten Zellen in vitro und, wie wir gezeigt haben, in vivo, welche es für die Forschung und möglicherweise in zukünftige klinische Anwendungen verwendet werden. Es hat auch den Vorteil, permeabilisierenden Zellen in einem räumlich restriktiv, was beweisen könnte, um ein wertvolles Forschungsinstrument sein.
Introduction
Mit der Entwicklung der Biomedizin und das Verständnis der Zellmechanik, die Lieferung von Biomolekülen in Zellen ist unerlässlich geworden, um viele Forschungsfelder und medizinische Therapien. Verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Fremdmolekülen durch die Plasmamembran und in das Zell-Cytosol einzuführen. Virale, chemische oder mechanische Techniken: Diese können in der Regel entweder als klassifiziert werden. Viral Techniken genetisches Material wie DNA und RNA mittels viraler Vektoren 1 transfizieren. Viral-Techniken sind in der Regel hohe Wirkungsgrade in bestimmten Zelllinien haben, aber sie haben das Potenzial für Immun-und Entzündungsreaktionen 2. Allgemeine chemische Transfektion Methoden gehören Fällung mit Calciumphosphat 3, bakterielle Exotoxine 4 und 5 Lipofektion. Diese Techniken haben sich als wirksam erwiesen, jedoch ergeben sich gewisse Probleme wie Zelltoxizität und Nicht-Spezifität. Weiterhin Techniken wie Calciumphosphate Niederschlag gefunden Transfektion Wirkungsgrade bis zu 70%, aber nur in bestimmten Zelllinien, primären Zellen selten in 6. Dies ist bemerkenswert, da zunehmende Forschungsanstrengungen werden in primären Zellen, insbesondere bei der Gestaltung verschiedene Behandlungen für die klinische Anwendung und die Untersuchung der DNA-Funktion setzen.
Zeitliche Unterbrechung der Zellmembran durch mechanische Reize ist eine Alternative zur Einführung von Fremdmolekülen in die Zellen. Techniken umfassen: Mikroinjektion von Molekülen 7, Elektroporation unter Verwendung eines elektrischen Feldes, um die Membran 8,9 stören Sonoporation mit Ultraschallwellen, um die Zellmembran 10-12, Partikelbeschuss stören, wie durch das "Gen-Kanone", die Teilchen gebunden schießt nachgewiesen Gene in der Zelle 13, und in jüngster Zeit die Anwendung von Schubspannung, die gezeigt worden ist, zeitlich permeabilisiert Säugerzellen 14,15. Obwohl Mechanikeral Methoden vermeiden einige der oben genannten Probleme, werden sie in der Regel durch geringere Wirkungsgrade und sehr komplexen und spezialisierten Setups begleitet. Ein Atmosphärendruck-Glimmentladung Brenner (APGD-t) wurde an der McGill mit dem anfänglichen Ziel der Funktionalisierung von Oberflächen-und Abnahme adhärenten Zellen in vitro 16 entwickelt. Serendipitously wurde entdeckt, dass eine lebend / tot-Färbung verwendet wurde, irgendwie in die von Zellen ohne Permeabilisierung Mittel versetzt entnommen. Außerdem schien dies nur in eingeschränkten Bereichen der Vertiefungen, die mit der Fackel Pfad übereinstimmen passiert aufgetreten. Untersuchung der Permeabilisierung Fähigkeiten des APGD-t fortgesetzt und in Kontrollstudien wurde festgestellt, daß die Träger inerten Gasstrahl des Plasma ohne Anregung war auch in der Lage, Zellen zu permeabilisieren. Dies wider die anfängliche Hypothese, dass die durch den Plasmastrahl reaktiven Spezies vorübergehend das Membranfunktion beeinträchtigt und schlug vor, einfach die mechanischeschen Kräfte waren ausreichend, um Zellpermeabilisierung verursachen. Von hier, in unserem Labor weiter Studien zu versuchen und zu quantifizieren und charakterisieren die Permeabilisierung Effizienz eines inerten Gasstrahl sowie Blick auf seine Fähigkeiten Transfektion 16.
Durch diese Untersuchungen wurde gefunden, dass Mikroporen in der Tat in Form der Plasmamembran, und diese Poren neigen dazu, innerhalb von etwa 5 Sekunden 15 verschließen. Wir haben Nützlichkeit der Technik der in vitro und in vivo in der Chorioallantoismembran eines Hühnerembryos zeigten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Schutzgasstrahl Permeabilisierung ist eine nützliche Technik für adhärenten Zell Transfektion. Es bietet die Möglichkeit, Biomoleküle in Zellen unter Verwendung von mechanischen Kräften, die die Notwendigkeit einer potentiell schädlichen Chemikalien oder virale Vektoren beseitigt übertragen. Die Technik könnte möglicherweise geben Forscher und Kliniker eine effiziente und relativ einfache Möglichkeit, genau Transfektion von Zellen. Die Selektivität der Permeabilisierung ist auch einzigartig so dass die Forsc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die folgenden Finanzierungsquellen haben: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
