Perméabilisation des cellules adhérant à l'aide d'un gaz inerte Jet

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour la perméabilisation temporaire de cellules adhérentes au moyen d'un jet de gaz inerte. Cette technique facilite le transfert de matériel génétique et de biomolécules dans des cellules de mammifères adhérentes par l'utilisation des forces mécaniques pour rompre la membrane de plasma.

Résumé

Diverses techniques de transfection cellulaire existent et peuvent être décomposés en trois grandes catégories: virale, chimiques et mécaniques. Ce protocole décrit un procédé mécanique pour perméabiliser les cellules adhérentes dans le temps au moyen d'un jet de gaz inerte qui peut faciliter le transfert de macromolécules normalement non-perméables dans des cellules. Nous croyons que cette technique fonctionne en transmettant des forces de cisaillement sur la membrane plasmique des cellules adhérentes, ce qui entraîne la formation de micropores temporaire. Une fois que ces pores sont créés, puis les cellules sont perméables à du matériel génétique et d'autres biomolécules. Les forces mécaniques impliquées ne courent le risque de cellules en permanence endommager ou de détachement de leur support. Il est, par conséquent, une gamme étroite de la dynamique des gaz inertes où la technique est efficace. Un jet de gaz inerte, s'est avérée efficace pour la perméabilisation de diverses lignées cellulaires adhérentes, y compris les cellules HeLa, HEK293 et ​​des cellules endotheliales aortiques abdominaux humains. Ce protocole est approprié pour la permeabilization de cellules adhérentes à la fois in vitro et, comme nous l'avons démontré, in vivo, montrant qu'il peut être utilisé pour la recherche et potentiellement dans de futures applications cliniques. Il a aussi l'avantage de perméabilisation des cellules d'une manière restrictive l'espace, ce qui pourrait s'avérer un précieux outil de recherche.

Introduction

Avec l'évolution de la biomédecine et la compréhension de la mécanique des cellules, la livraison de biomolécules dans les cellules est devenu vital pour de nombreux domaines de recherche et les traitements médicaux. Différentes techniques ont été mises au point pour introduire les molécules étrangères à travers la membrane plasmique et dans le cytosol de la cellule. Ceux-ci peuvent généralement être classés comme étant soit: techniques virales, chimiques ou mécaniques. Techniques virales peuvent transfecter matériel génétique tel que l'ARN et de l'ADN en utilisant des vecteurs viraux ^1. Techniques virales ont tendance à avoir des rendements él....

Protocole

Une. Programme de développement des LabView

1. Un régulateur de débit massique (MKS M100B Mass-Flo Controller) est fixée à la conduite de gaz d'hélium à assurer un débit de gaz précis. Cette unité est commandée par une tension d'entrée, compris entre 0 et 5 V. Une boucle de commande dans le programme de LabView détermine la tension requise à un moment donné. L'interfaçage entre l'ordinateur et le contrôleur de débit massique est exécutée par un dispositif d'acquisition de données (NI USB-6009), et une alimentation électrique de 12 V alimente le régulateur de débit massique.
2. Deux coulisseaux de positionnement linéaires sont utilis....

Résultats

La perméabilisation de cellules HeLa avec 10 kDa de dextran fluorescent vert à l'aide d'un jet de gaz d'hélium avec un capillaire de diamètre intérieur de 0,86 mm est représenté sur la figure 1. Les cellules ont été contre immédiatement après perméabilisation avec 2 pl / ml EthD-1 solution (LIVE / DEAD viabilité / cytotoxicité Kit) pour visualiser la mort cellulaire. Immédiatement après une contre-coloration, lamelles ont été montées et imagés. Cette figure montre les résultats d'exploit.......

Discussion

Jet de gaz inerte perméabilisation est une technique utile pour la transfection de cellules adhérentes. Il offre la possibilité de transférer des biomolécules dans des cellules à l'aide de forces mécaniques, ce qui élimine le besoin pour des produits chimiques potentiellement nocives ou des vecteurs viraux. La technique pourrait permettre aux chercheurs et aux cliniciens un moyen efficace et relativement simple pour la transfection des cellules précisément. La sélectivité de la perméabilisation est également unique .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Protéine fluorescente verte pour des expériences de transfection sur cellules HeLa
Dextran, AlexaFluor 488 ; 10 000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran pour les expériences de perméabilisation
LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité	Life Technologies Inc.	L3224	pour la contre-coloration des cellules de mammifères
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	pour le montage de lames lors de l’imagerie
Haute Pureté Hélium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T	;
Média Hyclone DMEM/ High Glucose - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	pour cellules HeLa
Sérum fœtal bovin	Invitrogen	26140079	Pour milieu DMEM
Pénicilline-Streptomycine, liquide	Invitrogen	15140-122	Pour milieu DMEM
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x			Produit en laboratoire
;			Table 1. Liste des réactifs requis
Microplaques transparentes traitées TC à 6 puits	Corning	3506
#1 22 x 22 lamelles	Fisher	12-542B	;
Capillaires en verre	World Precision Instruments		WPI Informations de dimensionnement
ID (mm) : 1, 0.86, 0.68, 0.5 Commande # : 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Contrôleur Mass-Flo	MKS	M100B01314CS1BV	Contrôleur de débit massique, série M100B, nécessite une alimentation externe 12 V
Périphérique d’acquisition de données USB-6009	National Instruments	779026-01	;
Ensemble UniSlide avec moteur pas à pas et contrôleur	Velmex		Deux ensembles UniSlide de la série MA15, équipés de moteurs pas à pas Vexta 1,8 po fournis par Velmex et contrôlés par un contrôleur de moteur pas à pas VXM
.			Tableau 2. Liste de l’équipement requis

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