Permeabilization من خلايا منضمون باستخدام غاز خامل جت
Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لpermeabilization مؤقتة من الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل. هذه التقنية تسهل نقل المادة الوراثية والجزيئات الحيوية في خلايا الثدييات ملتصقة بها استخدام القوات الميكانيكية لتعطيل غشاء البلازما.
Abstract
توجد تقنيات مختلفة ترنسفكأيشن الخلية وهذه يمكن تقسيمها إلى ثلاث فئات عريضة: الفيروسية والكيميائية والميكانيكية. يصف هذا البروتوكول وسيلة ميكانيكية لpermeabilize زمنيا الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل التي يمكن أن تسهل نقل الجزيئات عادة غير قابلة للاختراق في الخلايا. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب يعمل عن طريق نقل قوى القص على غشاء البلازما من الخلايا الملتصقة، مما أدى إلى تشكيل مؤقت لmicropores. مرة واحدة يتم إنشاء هذه المسام، والخلايا هي قابلة للاختراق ثم إلى المادة الوراثية والجزيئات الحيوية الأخرى. القوات الميكانيكية المعنية لا تتعرض لخطر الخلايا الضارة بشكل دائم أو فصل من الركيزة الخاصة بهم. هناك، بالتالي، على نطاق ضيق من ديناميات غاز خامل حيث الأسلوب هو فعالة. وقد ثبت طائرة غاز خامل كفاءة في permeabilizing مختلف خطوط الخلايا الملتصقة بما في ذلك هيلا، HEK293 والخلايا البطانية الأبهر البطني الإنسان. هذا البروتوكول هو مناسبة لعermeabilization من الخلايا الملتصقة على حد سواء في المختبر، وكما أثبتنا، في الجسم الحي، والتي تبين أنها يمكن أن تستخدم لأغراض البحث ويحتمل أن تكون في التطبيقات السريرية في المستقبل. كما أن لديها ميزة permeabilizing الخلايا بطريقة تقييدية مكانيا، والتي يمكن أن تكون أداة بحث قيمة.
Introduction
مع تطور الطب الحيوي وفهم الميكانيكا الخلية، وأصبح تسليم الجزيئات الحيوية في الخلايا الحيوية لكثير من مجالات البحث والعلاجات الطبية. وقد تم تطوير تقنيات مختلفة لإدخال جزيئات الأجنبية من خلال غشاء البلازما والخلايا في العصارة الخلوية. هذه يمكن أن تصنف عموما إما: تقنيات الفيروسية أو الكيميائية أو الميكانيكية. يمكن أن تقنيات الفيروسية بالنقل المواد الجينية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام ناقلات فيروسية 1. تقنيات الفيروسية تميل إلى أن تكون الكفاءة عالية في خطوط الخلايا معينة، ولكن لديهم القدرة على التفاعلات المناعية والتهابات 2. وتشمل أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية المشترك مع هطول فوسفات الكالسيوم 3، 4 والسموم الناتجة عن بعض بكتيريا lipofection 5. وقد أثبتت هذه التقنيات لتكون فعالة، ومع ذلك، تنشأ مشاكل معينة مثل السمية الخلوية وغير النوعية. علاوة على ذلك، تقنيات مثل الفوسفاط الكالسيومتم العثور على البريد هطول أن يكون الكفاءة ترنسفكأيشن تصل إلى 70٪ ولكن فقط في خطوط الخلايا معينة، ونادرا ما في الخلايا الأولية 6. هذا هو من المذكرة كما يتم وضع زيادة الجهود البحثية في الخلايا الأولية، وخاصة في حالة تصميم العلاجات المختلفة للاستخدام السريري ودراسة سير الحمض النووي.
تعطل الزمني للغشاء الخلية من خلال المحفزات الميكانيكية هو بديل لإدخال جزيئات الأجنبية إلى الخلايا. وتشمل التقنيات: Microinjection من جزيئات 7، التثقيب الكهربائي باستخدام مجال كهربائي لتعطيل الغشاء 8،9، باستخدام الموجات فوق الصوتية sonoporation لتعطيل غشاء الخلية 10-12، الجسيمات القصف كما يدل على ذلك "مدفع الجينات"، الذي يطلق النار على جزيئات ملزمة مع الجينات في الخلية 13، ومؤخرا، وتطبيق إجهاد القص السوائل التي قد تظهر لpermeabilize زمنيا خلايا الثدييات 14،15. على الرغم من ميكانيكيطرق آل تجنب بعض القضايا المذكورة آنفا، وعادة ما تصاحبها الكفاءة أقل والاجهزة المعقدة جدا والمتخصصة. وقد وضعت الشعلة توهج التفريغ الضغط الجوي (APGD تي) في ماكغيل مع الهدف الأولي من functionalizing الأسطح وفصل الخلايا الملتصقة في المختبر 16. مصادفة، تم اكتشاف أن وصمة العيش / قتيلا تستخدم على نحو ما كان يجري اتخاذها في الخلايا من دون وكيل permeabilizing إضافتها. وعلاوة على ذلك، وهذا يبدو أنه لم يحدث إلا في مناطق محدودة من الآبار التي حدثت لمتابعة المباراة مع مسار الشعلة. واصلت التحقيق في قدرات permeabilization من APGD-t و في دراسات المراقبة، تبين أن الطائرة غاز خامل الناقل من البلازما دون الإثارة كانت أيضا قادرة على permeabilize الخلايا. هذا يتناقض مع الفرضية الأولية أن رد الفعل الأنواع التي أوجدتها البلازما النفاثة ضعف وظيفة الغشاء مؤقتا واقترح ببساطة المطاط ووكانت قوات كال كافية للتسبب permeabilization الخلية. من هنا، واصلت الدراسات في المختبر في محاولة لتحديد وتوصيف كفاءة permeabilization من طائرة غاز خامل وكذلك نظرة على قدرات ترنسفكأيشن في 16.
من خلال هذه الدراسات، فقد وجد أن micropores القيام به في شكل الواقع في غشاء البلازما، وهذه المسام تميل إلى ختم غضون ما يقرب من 5 ثانية 15. لقد أثبتنا فائدة هذه التقنية في المختبر والمجراة في غشاء مشيمائي من جنين الفرخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
خاملة permeabilization طائرة الغاز هو تقنية مفيدة لترنسفكأيشن الخلية ملتصقة. لأنها توفر القدرة على نقل الجزيئات الحيوية في الخلايا مع استخدام القوات الميكانيكية، مما يلغي الحاجة إلى المواد الكيميائية الضارة المحتملة أو ناقلات فيروسية. تقنية يحتمل أن تعطي الباحثين والأطبا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر مصادر التمويل التالية: كندية معاهد للأبحاث الصحية (CIHR)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
