عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام
Summary
عزل وتوصيف الدهون ومجال عديد السكاريد الشحمي (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام يوفر نظرة ثاقبة الآليات القائمة على سطح الخلية المقاومة للمضادات الحيوية، وبقاء البكتيرية واللياقة البدنية، وكيف كيميائيا الدهون المتنوعة والأنواع الجزيئية تعدل تفاضلي المضيف الاستجابات المناعية الفطرية.
Abstract
عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو رئيسي جزيء سطح الخلية من البكتيريا سالبة الجرام، تترسب على النشرة الخارجي من طبقة ثنائية الغشاء الخارجي. ويمكن تقسيم LPS في ثلاثة مجالات: القاصي O-السكاريد، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون والمجال تتكون من الدهون والأنواع الجزيئية وبقايا حمض ديوكسي 3-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO). الدهون والمجال هو العنصر الوحيد الضروري لبقاء الخلية البكتيرية. التوليف التالية لها، والدهون غير معدلة كيميائيا في استجابة للضغوط البيئية مثل درجة الحموضة أو درجة الحرارة، لتعزيز المقاومة لمركبات المضادات الحيوية، والتهرب من الاعتراف من قبل وسطاء من الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة. بروتوكول التالية تفاصيل العزلة الصغيرة والكبيرة الحجم والدهون A من البكتيريا سالبة الجرام. ثم وتتميز المواد معزولة كيميائيا بواسطة طبقة رقيقة اللوني (TLC) أو مطياف الكتلة (MS). بالإضافة إلى مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت لوضوء (MALDI-TOF) MS، ونحن أيضا تصف جنبا إلى جنب MS بروتوكولات لتحليل الدهون والأنواع الجزيئية باستخدام التأين electrospray (ESI) بالإضافة إلى الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) والإنحلال الضوئي فوق البنفسجية المستخدمة حديثا (UVPD) الأساليب. بروتوكولات MS دينا تسمح لتحديد لا لبس فيه من التركيب الكيميائي، أهمية قصوى لتوصيف جزيئات الدهون والتي تحتوي على التعديلات الكيميائية الفريدة أو الرواية. نحن أيضا وصف تسمية بالنظائر المشعة، والعزلة لاحقة، من الدهون (أ) من الخلايا البكتيرية لتحليلها من قبل TLC. نسبة إلى بروتوكولات يستند إلى MS-، TLC يوفر طريقة توصيف أكثر اقتصادا وسريع، ولكن لا يمكن أن تستخدم لتعيين بشكل لا لبس فيه الدهون والبنى الكيميائية دون استخدام معايير التركيبة الكيميائية المعروفة. على مدى العقدين الماضيين أدى عزل وتوصيف الدهون A إلى العديد من الاكتشافات المثيرة التي تحسنت فهمنا للعلم وظائف الأعضاء من البكتيريا سالبة الجرام، آليات المقاومات للمضادات الحيويةوقد وفرت اتجهت الاستجابة المناعية الفطرية الإنسان، والعديد من أهداف جديدة في تطوير مركبات مضادة للجراثيم.
Introduction
عديد السكاريد الشحمي (LPS) هو جزيء السطح الخارجي رئيسية من الكائنات سالبة الجرام تقريبا كل ويتكون من ثلاثة مجالات الجزيئية: أ-O مستضد السكاريد البعيدة، وهو قليل السكاريد الأساسية، والدهون المرتبطة الغشاء والمجال تترسب على النشرة الخارجي لل الغشاء الخارجي طبقة ثنائية 1،2. الدهون والمجال يتكون من 3 ديوكسي-D-مانو أكتوبر-2-ulosonic (KDO) المخلفات والدهون والأنواع الجزيئية، حيث الدهون ويمكن تعريفها بأنها جزء من كلوروفورم للذوبان من LPS على التحلل خفيفة حمض 1، 2. الدهون القياسية جزيء يمكن تعريفها كيميائيا بمثابة العمود الفقري diglucosamine هذا هو ومكرر فسفرته-acylated سداسي؛ متسقة مع الأنواع الدهنية والتي لوحظت في نموذج كائن كولاي (كولاي) 1،2. تسعة جينات أعرب جوهري، الحفظ في جميع أنحاء البكتيريا سالبة الجرام، هي المسؤولة عن إنتاج الدهون مجال (الشكل 1) 1،2. معظم البكتيريا لديها مجموعة إضافية من الجينات، التي تختلف في درجة الحفظ النشوء والتطور، التي تشارك في مزيد من التعديل الكيميائي للدهون A 3. نزع الفسفات، وإزالة السلاسل أسيل، وإضافة الأنصاف الكيميائية مثل السكريات الأمينية (على سبيل المثال aminoarabinose) و / أو phosphoethanolamine هي الأكثر شيوعا لوحظ الأنشطة (الشكل 1). يتم تنشيط العديد من الإنزيمات المسؤولة عن الدهون والتعديل مباشرة عن طريق إشارات البيئية، مثل الكاتيونات ثنائي التكافؤ، أو ينظم التعبير عنها من قبل اثنين من أنظمة الاستجابة منظم مكون 3.
وتتوسط الاعتراف الأنواع الدهون A من قبل المضيف نظام المناعة الفطرية التي تول مثل مستقبلات عامل التمايز 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) شارك في مستقبلات 4. قوات مسعور بين MD2 والدهون وسلاسل أسيل، وكذلك بين TLR4 و 'مجموعات الفوسفات 1 و 4 من الدهون وتعزيز علاقة قوية من الشفةمعرف A مع TLR4/MD2 4،5. التعديلات التي تغير حالة أسيلة أو شحنة سالبة من الدهون والدهون تأثير TLR4/MD2 يستند الاعتراف والتحفيز المصب من الاستجابة المناعية الفطرية تفعيل NF كيلوبايت وسطاء الالتهاب مثل TNFα وIL1-β 6،7. التعديلات التي تحجب شحنة سالبة من الدهون وأيضا منع جراثيم الببتيدات المضادة للميكروبات الموجبة من الربط إلى سالبة الجرام سطوح الخلايا 3،8. وافترض كثير من الدهون وتعديلات لزيادة اللياقة البدنية البكتيرية تحت ظروف بيئية معينة، مثل داخل المضيف الإنسان أو في مكانة الايكولوجية. لهذا السبب كثير من الإنزيمات تعديل أهدافا جذابة في تطوير عقلانية من المركبات المضادة للميكروبات. التنوع الكيميائي للهياكل الدهون A، فيما يتعلق الحي و / أو البيئة، والآثار البيولوجية من هذه الهياكل المتنوعة جعل توصيف الهيكلية من الدهون ومسعى هاما في روقال انه يدرس من البكتيريا سالبة الجرام.
عزل جزيئات الدهون A من البكتيريا كله ينطوي على استخراج LPS من سطح الخلية البكتيرية، وهي خطوة المائي لتحرير الدهون A، يليه إجراء تنقية النهائي 9-11. الإجراء استخراج LPS في معظم الأحيان واستشهد هو الإجراء استخراج المياه الساخنة الفينول، لأول مرة من قبل ويستفال جن 10. بعد تعرض استخراج LPS كله إلى خفيفة حمض المائي الذي يفصل كيميائيا KDO من الهيدروكسيل-6'من السكر الجلوكوزامين البعيدة من الدهون A (الشكل 1). وجود مطبات عديدة لإجراء المياه الساخنة الفينول بما في ذلك استخدام كاشف المخاطر العالية، يطلب ضرورة للحط من الأحماض المستخرجة التعاون النووي والبروتينات، وعدة أيام لاستكمال البروتوكول 10.
وقد مختبرنا تطويرها استخراج وعزل الدهون وكما وضعت أول من Caroff ورايتز وهو 12،13. مقارنة مع الإجراءات المياه الساخنة الفينول، وطريقة المقدمة هنا هي أكثر سرعة وكفاءة ويستوعب مجموعة واسعة من وحدات التخزين الثقافة من 5 مل ليتر متعددة. وعلاوة على ذلك، على عكس الاستخراج المياه الساخنة الفينول، أسلوبنا لا تحديد لأنواع السلس الخام أو من LPS، وتوفير الانتعاش الأمثل من أنواع الدهون A. في بروتوكول لدينا، يتم تنفيذ تحلل المواد الكيميائية من الخلايا البكتيرية كله باستخدام مزيج من الكلوروفورم والميثانول والماء، حيث يمكن مكعبات LPS بواسطة الطرد المركزي. وتستخدم مجموعة من التحلل خفيفة الحمضية والاستخراج بالمذيبات (بلاي-داير) لتحرير الدهون A من السكاريد المرفقة تساهميا. تم تطبيق أسلوب بليغ وداير أولا إلى استخراج أنواع الدهون من مجموعة متنوعة من الأنسجة الحيوانية والنباتية 14 أو تعديلها هنا لفصل السكاريد تحلل من الدهون A. في هذه الخطوة الانفصال النهائي، والكلوروفورم الدهون القابلة للذوبان تقسيم انتقائي في أقل العضوية المرحلة. لمزيد من تنقية الدهون A، عكس المرحلة أوأنيوني عمود التبادل اللوني يمكن استخدام 12.
بعد عزلة من نوع الدهون من الخلايا بأكملها، عددا من الأساليب التحليلية يمكن استخدامها لتوصيف التركيب الكيميائي للمواد المعزولة مثل الرنين المغناطيسي، TLC، وتحليل يستند إلى MS-. NMR يسمح للتوضيح الهيكلية غير مدمرة، ويقدم تفاصيل الهيكلية المتعلقة الروابط غليكوزيدية، الاحالة لا لبس فيه من مواقف سلسلة أسيل، وتعيين مواقع المرفقات للA التعديلات الدهون مثل aminoarabinose أو phosphoethanolamine 15-17. لم يتم مناقشتها تحليل NMR من الدهون وضمن بروتوكول لدينا، ولكن تم صفها على نحو كاف في أماكن أخرى 15،16. للتحليل السريع TLC استنادا تستخدم أساليب كثير من الأحيان، لكنه يفشل في تقديم معلومات مباشرة حول التركيبة الكيميائية غرامة. بروتوكولات MS تستند هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لتوصيف والهياكل الدهون 18،19. المصفوفة المرتبطة الليزر الامتزاز التأين (MALDIوكثيرا ما يستخدم)-MS لمسح الأنواع في البداية سليمة الدهون A. يتم إنشاء الأيونات المشحونة منفردة من الحليلة أعدت وفقا للإجراءات استخراج لدينا. كما هو مطلوب التحليل البنيوي أكثر غرامة، على أساس أساليب MS / MS تكون أكثر إفصاحا من MALDI-MS. إلى جانب لالتأين electrospray (ESI) الدهون اتهم منفردة أو ضرب A أيونات السلائف هي مزيد مجزأة عن طريق الاصطدام الناجم عن تفكك (CID) أو الإنحلال الضوئي فوق البنفسجية (UVPD)، لتوليد أيونات المنتج بالمعلومات هيكليا 18،20،21. وكثيرا ما ولدت أيضا المنتجات وفقدان محايدة من الدهون والأيونات السلائف خلال ESI-MS توفير طبقة إضافية من المعلومات الهيكلية.
وقد ثبت جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) لتكون وسيلة لا غنى عنها وتنوعا لتوضيح هياكل الدهون A. خلال MS / MS، يتم تنشيط أيونات لانتاج نمط تجزئة التشخيصية التي يمكن استخدامها لتوضيح هيكل أيون السلائف. لافا على نطاق واسعilable طريقة MS / MS هو CID. وتنتج هذه الطريقة الأيونات عبر جزء اصطدام السلائف أيون اختيارها بغاز خامل الهدف، مما أدى إلى ترسب الطاقة الذي يؤدي إلى التفكك. وقد ثبت CID أداة حاسمة في تخصيص الدهون هيكل لمجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية 22-33.
على الرغم من أن إدارة البحث الجنائي هو الأكثر تنفيذا عالميا طريقة MS / MS، فإنه يولد مجموعة محدودة من الأيونات المنتج. 193 نانومتر UVPD هو البديل والتكميلي الأسلوب MS / MS. يستخدم هذا الأسلوب الليزر لأشرق الأيونات، وامتصاص الفوتونات النتائج في energization من الأيونات والتفكك اللاحقة. هذه الطاقة أعلى MS / MS تقنية تنتج مجموعة أكثر تنوعا من المنتجات من الأيونات CID وبالتالي يوفر أنماط تجزئة أكثر بالمعلومات. على وجه الخصوص، UVPD يتيح المعلومات حول التغييرات الطفيفة في أنواع الدهون وبناء على الانشقاقات في غليكوزيدية، أمين، أسيل وCC ربط السندات 18،21،34.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول قمنا المفصل عزلة هناك أنواع الدهون من الخلايا كاملة من البكتيريا، ووصف TLC أو الأساليب التحليلية القائمة على MS لتوصيف هذه المواد كيميائيا معزولة. جنبا إلى جنب مطياف الكتلة هو استراتيجية قوية لدي نوفو توصيف الهيكلية من المركبات البيولوجية، ولا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منح AI064184 وAI76322 من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وغرانت 61789-MA-MUR من مكتب أبحاث الجيش للبحوث MST كان مدعوما أيضا من قبل مؤسسة ولش منحة المعاهد الوطنية للصحة منح F1155 وR01GM103655 إلى JSB
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
References
- Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
- Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
- Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
- Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
- Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
- Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
- Westphal, O. a. J., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
- Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
- Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
- Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
- Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
- Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
- Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
- Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
- Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
- Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
- Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
- Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
- Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
- Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
- El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
- Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
- Lee, C. -. S., Kim, Y. -. G., Joo, H. -. S., Kim, B. -. G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
- Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
- Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
- Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -. L., Afonso, C., Tabet, J. -. C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
- Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
- Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
- Jones, J. W., Cohen, i. e., Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
- Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
- Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
- Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
- Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
- Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
- Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
- Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
- Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).
