Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Summary

Isolement et caractérisation des lipides Un domaine de lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif donne un aperçu des mécanismes de surface cellulaire sur la base de la résistance aux antibiotiques, la survie des bactéries et de remise en forme, et comment chimiquement lipidique diversifié A espèces moléculaires moduler différemment les réponses immunitaires innées de l'hôte.

Abstract

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface cellulaire des bactéries gram-négatives, déposée sur le feuillet externe de la bicouche de la membrane externe. LPS peuvent être subdivisés en trois domaines: le O-polysaccharide distale, un oligosaccharide de noyau, et le lipide A domaine constitué d'un lipide A des espèces moléculaires et des résidus d'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo). Le lipide A est le seul domaine composant essentiel pour la survie de la cellule bactérienne. Suite à la synthèse, le lipide A est chimiquement modifiée en réponse à des stress environnementaux tels que le pH ou la température, de favoriser la résistance aux composés antibiotiques, et d'échapper à la reconnaissance par les médiateurs de la réponse immunitaire innée hôte. Le protocole suivant détaille l'isolement à petite et grande échelle de lipide A partir de bactéries gram-négatives. Matériau isolé chimiquement est alors caractérisé par chromatographie sur couche mince (TLC) ou la spectrométrie de masse (MS). En plus de laser assistée par matrice de désorption / ionisation à temps de flumière (MALDI-TOF) MS, nous décrivons également les protocoles MS en tandem pour l'analyse des lipides Une espèce moléculaire en utilisant l'ionisation électrospray (ESI) couplée à dissociation induite par collision (CID) et nouvellement employés photodissociation ultraviolet (UVPD) des méthodes. Nos protocoles de MS permettent une détermination sans faille de la structure chimique, primordiale pour la caractérisation de molécules lipidiques A qui contiennent des modifications uniques ou de nouveaux produits chimiques. Nous décrivons également l'étiquetage radio-isotopique, et isolement subséquent, de lipide A partir de cellules bactériennes pour l'analyse par CCM. Par rapport à des protocoles MS, CCM fournit une méthode de caractérisation plus économique et plus rapide, mais ne peut pas être utilisé pour attribuer sans ambiguïté lipide A structures chimiques sans l'utilisation des normes de la structure chimique connue. Au cours des deux dernières décennies isolement et la caractérisation de lipide A a conduit à de nombreuses découvertes passionnantes qui ont amélioré notre compréhension de la physiologie des bactéries, des mécanismes de résistance aux antibiotiques à Gram négatiftance, la réponse immunitaire innée humaine, et ont fourni de nombreuses nouvelles cibles pour le développement de composés antibactériens.

Introduction

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface extérieure de presque tous les organismes gram-négatif et est constituée de trois domaines moléculaires: un antigène O polysaccharidiques distale, un oligosaccharide de noyau et le lipide associé à la membrane Un domaine déposé sur le feuillet externe de la membrane bicouche externe ^1,2. Le lipide Un domaine se compose de 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) les résidus et un lipide une espèce moléculaire, où le lipide A peut être définie comme la fraction soluble dans le chloroforme de LPS lors de l'hydrolyse légère acide ^{1, 2.} Le lipide A de la molécule de type peut être défini chimiquement comme une épine dorsale qui est diglucosamine hexa-acylé et le bis-phosphorylé, en accord avec les principales espèces de lipide A observées dans l'organisme modèle Escherichia coli (E. coli) ^1,2. Neuf gènes exprimés de manière constitutive, conservés tout au long de bactéries gram-négatives, sont responsables de la production du domaine de lipide A (Figure 1) ^1,2. La plupart des bactéries ont un jeu supplémentaire de gènes, qui varient en degré de conservation phylogénétique, qui participent à une autre modification chimique du lipide A ^3. La déphosphorylation, l'élimination des chaînes acyle, et l'addition de groupements chimiques, tels que des amino-sucres (par exemple aminoarabinose) et / ou de la phosphoéthanolamine sont les activités les plus fréquemment observés (Figure 1). Beaucoup des enzymes responsables de lipides Une modification sont directement activés par des signaux environnementaux, tels que des cations bivalents ou leur expression est régulée par deux systèmes de réponse-régulateur composants ^3.

Reconnaissance d'espèces lipidiques A par le système immunitaire inné hôte est médiée par le récepteur de type Toll-like facteur de différenciation 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-récepteur ^4. Forces hydrophobes entre MD2 et le lipide A des chaînes acyle, ainsi qu'entre TLR4 et les 1 et 4 'groupes phosphates de lipide A promouvoir la forte association de la lèvreid avec TLR4/MD2 ^4,5. Les modifications qui modifient l'état d'acylation ou la charge négative du lipide A à base de lipide A TLR4/MD2 incidence reconnaissance et en aval de la stimulation de la réponse immunitaire innée activateurs de NF-kB et de médiateurs de l'inflammation tels que TNFa et IL1-β ^6,7. Modifications qui masquent la charge négative de lipide A éviter également des peptides antimicrobiens cationiques bactéricides de se lier à Gram négatif surfaces cellulaires ^3,8. De nombreuses modifications de lipide A sont émis l'hypothèse d'améliorer la condition physique des bactéries dans des conditions environnementales spécifiques, tels que l'intérieur de l'hôte humain ou dans une niche écologique. Pour cette raison, de nombreuses enzymes de modification sont des cibles intéressantes dans le développement rationnel de composés antimicrobiens. La diversité chimique des structures lipidiques A, par rapport à l'organisme et / ou de l'environnement, et les implications biologiques de ces diverses structures rendre la caractérisation structurale de lipide A un effort important dans de til étudier des bactéries gram-négatives.

L'isolement des molécules de lipide A de bactéries entières implique l'extraction de LPS à partir de la surface de la cellule bactérienne, une étape d'hydrolyse pour libérer le lipide A, suivie par une procédure de purification finale ^9-11. Le LPS procédure la plus fréquemment citée d'extraction est le chaud phénol procédure d'extraction de l'eau, d'abord introduit par Westphal et Jann ^10. Après extraction LPS ensemble est soumis à une hydrolyse douce-acide, qui sépare chimiquement Kdo de la 6'-hydroxy du sucre de glucosamine distale du lipide A (figure 1). De nombreux écueils existent pour la procédure de l'eau chaude-phénol y compris l'utilisation d'un réactif de risque élevé, la nécessité de dégrader les acides co-extraits nucléiques et des protéines, et plusieurs jours sont nécessaires pour compléter le protocole ^10.

Notre laboratoire a développé l'extraction et l'isolement du lipide A comme premier développé par Caroff et Raetz ^12,13. Par rapport aux procédés de l'eau chaude-phénol, le procédé présenté ici est plus rapide et efficace et s'adapte à une large gamme de volumes de culture de 5 ml à plusieurs litres. En outre, contrairement à l'extraction de l'eau chaude-phénol, notre méthode ne sélectionne pas pour rugueuses ou lisses-types de LPS, en fournissant une récupération optimale des espèces lipidiques A. Dans notre protocole, la lyse chimique des cellules bactériennes entières est effectuée en utilisant un mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau, où LPS peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation. Une combinaison d'une hydrolyse douce-acide et extractions par solvant (Bligh-Dyer) sont utilisés pour libérer le lipide A de polysaccharide lié de manière covalente. La méthode de Bligh et Dyer a été appliqué d'abord à l'extraction d'espèces lipidiques à partir d'une variété d'animaux et des végétaux tissus ^14, modifié ici pour séparer le polysaccharide hydrolysé de lipide A. Dans cette étape de séparation finale, le chloroforme lipides solubles partitionner de manière sélective dans la phase organique inférieure phase. Pour purifier davantage le lipide A, en phase inverse ouChromatographie sur colonne d'échange anionique peut être utilisé ^12.

Après isolement des espèces lipidiques A partir de cellules entières, un certain nombre de méthodes d'analyse peut être utilisée pour caractériser la structure chimique de la matière d'isolement telles que la RMN, chromatographie sur couche mince, et l'analyse MS. RMN permet élucidation de la structure non-destructive, et fournit des détails structurel lié à des liaisons glycosidiques, l'attribution sans équivoque des positions de la chaîne acyle, et cession de sites de fixation pour le lipide A modifications comme aminoarabinose ou phosphoethanolamine ^15-17. analyse par RMN du lipide A n'est pas discutée au sein de notre protocole, mais a été correctement décrit ailleurs ^15,16. Pour une analyse rapide TLC basées méthodes sont fréquemment utilisées, mais ne parviennent pas à fournir des informations directes sur la structure de la chimie fine. Protocoles MS sont la méthode la plus fréquemment utilisée pour caractériser les structures lipidiques A ^18,19. Matrice associée ionisation par désorption laser (MALDI)-MS est souvent utilisé pour sonder initialement espèce de lipide A intactes. Ions à charge sont générés à partir analyte préparée selon nos procédures d'extraction. Comme l'analyse structurale plus fine est nécessaire, des méthodes basées MS / MS s'avèrent plus informatif que MALDI-MS. Couplé à ionisation électrospray (ESI) de lipides seuls ou à plusieurs charges A ions précurseurs sont encore fragmenté par dissociation induite par collision (CID) ou photodissociation ultraviolet (UVPD), pour générer des ions structurellement information sur les produits ^18,20,21. Produits de perte de neutre lipide A ions précurseurs sont également fréquemment générés pendant ESI-MS à fournir une couche supplémentaire d'information structurale.

Spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) s'est avérée être une méthode indispensable et polyvalent pour l'élucidation des structures lipidiques A. Au cours de MS / MS, les ions sont activés pour obtenir un schéma de fragmentation de diagnostic qui peut être utilisée pour élucider la structure de l'ion précurseur. Le plus largement available méthode MS / MS est CID. Cette méthode produit des ions fragmentés par collision de l'ion précurseur choisi avec un gaz inerte cible, ce qui entraîne le dépôt d'énergie qui conduit à la dissociation. CID s'est avéré un outil essentiel dans l'attribution des lipides Une structure pour un large éventail d'espèces bactériennes ^22-33.

Bien que le procédé est CID MS / MS plus universellement mis en oeuvre, il génère un éventail limité d'ions sur les produits. 193 nm UVPD est une alternative et complémentaire méthode MS / MS. Cette méthode utilise un laser pour irradier des ions, et l'absorption de photons se traduit par excitation des ions et la dissociation subséquente. Cette énergie technique MS / MS plus élevée produit un éventail plus diversifié d'ions produits que CID et fournit des modèles de fragmentation plus informatifs ainsi. En particulier, UVPD donne des informations sur les changements subtils dans les espèces lipidiques A sur la base de clivages au glycosidique, amine, acyle et CC obligations indexées ^18,21,34.

Protocol

Toutes les solutions doivent être préparées avec de l'eau ultra pure et méthanol de qualité HPLC et le chloroforme. Solutions préparées contenant des solvants organiques tels que le méthanol, le chloroforme, ou la pyridine et les acides concentrés ou de bases doivent être préparés et utilisés sous une hotte chimique. Toutes les solutions peuvent être stockées à température ambiante. Les solvants doivent être mesurés dans un cylindre de verre gradué et stockés dans des bouteilles en verre de solv…

Representative Results

Canonical lipide A de E. coli et Salmonella enterica sérotype Typhimurium est un disaccharide hexa-acylés de la glucosamine avec des groupes de phosphate à 1 – et 4 'positions. Au cours de la croissance dans des milieux riches (par exemple Luria Broth) une partie du lipide A contient un groupe pyrophosphate en position 1 qui donne une espèce de tris-phosphorylée 36 (figure 1). Kdo (3-désoxy-D-manno-octulosonique acide), est fixé à la 6&…

Discussion

Dans ce protocole, nous avons détaillé l'isolement des lipides Une espèce de cellules entières de bactéries, et décrit les méthodes d'analyse TLC ou MS pour caractériser chimiquement ce matériel isolé. Spectrométrie de masse tandem est une stratégie puissante pour de novo caractérisation structurale des composés biologiques, et est inestimable pour la caractérisation chimique de la panoplie de molécules lipidiques A observés dans la nature. CID et UVPD existe deux méthodes d'activa…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC Grade
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates	EMD Biosciences	5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer	Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters	New Obectives		≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator	Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes	Corning Pyrex	99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415	Corning	9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager)	BioRad	170-9400
Autoradiography Cassette	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
Phosphorscreen SO230	Kodak
Peptide Mass Standards Kit	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A	Branson	101063196
1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1