グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価
Summary
グラム陰性菌からのリポ多糖（LPS）のリピドAドメインの単離および特徴は、細胞表面の抗生物質耐性のベースのメカニズム、細菌の生存やフィットネス、そしてどのように化学的に多様な脂質分子種が差ホスト自然免疫応答を調節への洞察を提供します。
Abstract
リポ多糖（LPS）は、外膜二重層の外側リーフレット上に堆積されたグラム陰性菌の主要な細胞表面分子である。 LPSは、三つのドメインに細分することができる。遠位O-多糖、コアオリゴ糖、脂質および脂質からなるドメイン分子種および3 – デオキシ-D-マンノ – オクト-2 – ulosonic酸残基（のKdo）。リピドAドメインは、細菌細胞の生存に必須で唯一の成分である。その合成後、リピドAに化学的抗生物質化合物に対する耐性を促進するために、例えばpHまたは温度のような環境ストレスに応答して変更され、宿主自然免疫応答のメディエーターによる認識を回避する。以下のプロトコールは、グラム陰性細菌からのリピドAの小規模および大規模な単離を詳述する。単離された物質は、その後、化学的薄層クロマトグラフィー（TLC）または質量分析（MS）によって特徴付けられる。 fはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間に加えて、光（MALDI-TOF）MSは、我々はまた、衝突誘起解離（CID）に結合されたエレクトロスプレーイオン化（ESI）および新たに採用紫外光解離（UVPD）の方法を用いて脂質の分子種を分析するため、タンデムMSプロトコルを記載している。我々のMSプロトコルは、一意又は新規な化学修飾を含むリピドA分子の特徴付けに最も重要な、化学構造の明確な決定を可能にする。また、TLCによる分析のために細菌細胞からの脂質Aの放射性同位体標識、およびその後の単離を記載する。 MSベースのプロトコルに対して、TLCは、より経済的で迅速な特徴付け方法を提供するが、明確に知られている化学構造の基準を使用することなく、化学構造脂質を割り当てるために使用することができない。過去20年間の脂質Aの単離および特徴は、抗生物質抵抗のメカニズムをグラム陰性細菌の生理学の理解を改善している多数の刺激的な発見につながっているインダクタンス、人間の自然免疫応答、および抗菌性化合物の開発には多くの新しいターゲットを提供してきました。
Introduction
リポ多糖（LPS）は、ほぼすべてのグラム陰性菌の主要外表面分子であり、3つの分子のドメインで構成されています。遠位O抗原多糖、コアオリゴ糖、および膜結合脂質ドメインの外葉の上に堆積外膜二重層1,2。脂質ドメインは、リピドAは、温和な酸加水分解の際に1 LPSのクロロホルム可溶性部分として定義することができる3 -デオキシ-D-マンノ-オクト-2 – ulosonic（のKdo）残基および脂質分子種から構成され2。モデル生物大腸菌（E.coli）1,2で観察され、主要なリピドA種と一致して、標準的な脂質分子は、化学的にアシル化ヘキサ-およびビス -リン酸化されdiglucosamineバックボーンとして定義することができる。グラム陰性菌を通じて保存ナイン構成的に発現される遺伝子は、ドメイン（ 図1）1,2脂質の産生に関与している。ほとんどの細菌は、脂質3のさらなる化学修飾に参加系統発生の保存度が異なる遺伝子の追加セットを持っています。脱リン酸化、アシル鎖の除去、およびそのようなアミノ糖（ 例えば、アミノアラビノース）及び/又はホスホエタノールアミンなどの化学部分の付加は、最も一般的に観察された活性（ 図1）である。脂質修飾に関与する酵素の多くは、直接そのような二価の陽イオンのような環境シグナルによって活性化される、またはそれらの発現は二成分応答調節因子系3により調節される。
宿主自然免疫系による脂質A種の認識は、Toll様受容体4/myeloid分化因子2（TLR4/MD2）共受容体4により媒介される。 MD2および脂質のアシル鎖間、ならびにTLR4および脂質Aの1および4 'リン酸基間の疎水性力は、リップの強い会合を促進TLR4/MD2 4,5にID Aに。自然免疫応答の認識と下流刺激アシル化状態や脂質の負電荷の影響TLR4/MD2ベースの脂質を変化させる改変は、NF-κBおよびそのようなTNFαおよびIL1-β6,7などの炎症のメディエーターを活性化剤。リピドAの負の電荷をマスキング修飾はまた、細胞表面3,8のグラム陰性への結合から殺菌カチオン性抗菌性ペプチドを防止する。多くのリピドA修飾は、ヒト宿主の内部または生態的地位のように、特定の環境条件下で細菌の適応度を高めることが仮定される。この理由のために多くの修飾酵素は、抗菌性化合物の合理的開発における魅力的な標的である。リピドA構造の化学的多様性は、生物および/または環境、およびこれらの多様な構造の生物学的意味に対してリピドAの構造的特徴のtにおいて重要な努力をする彼は、グラム陰性菌の研究。
全細菌からのリピドA分子の単離は、最終的な精製手順9-11、続いて細菌細胞表面からのLPSの抽出、リピドAを遊離させる加水分解工程を伴う。最も頻繁に引用されたLPS抽出手順は、第ウェストファールとジャン10によって導入され、熱フェノール水抽出法である。抽出後、全体LPSは、化学的にリピドA（ 図1）の遠位グルコサミン糖の6'-ヒドロキシルからのKdoを分離軽度酸加水分解に供される。多数の落とし穴は、高い危険性試薬の使用を含む熱水フェノール手順のために共抽出された核酸およびタンパク質を分解する必要性が存在し、数日間は、プロトコル10を完了するために必要とされる。
最初CaroffとRaetz 12,13によって開発されたように私たちの研究室では、脂質Aの抽出および単離を開発しました。熱フェノール水手順と比較して、ここに提示した方法は、より迅速かつ効率的で、そして5mlから複数リットルの培養容量の広い範囲を収容する。また、ホットフェノール水抽出とは異なり、我々の方法は、リピドA種の最適な回復を提供する、LPSのラフや滑らかなタイプで選択されません。我々のプロトコルでは、全細菌細胞の化学的溶解は、LPSを遠心分離によりペレット化することができる、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物を用いて行われる。マイルド酸加水分解、溶媒抽出（ブライ – ダイアー）の組み合わせは、共有結合した多糖からリピドAを遊離するために使用される。ブライとダイアーのメソッドが最初に14組織が 、動物や植物の様々な脂質種の抽出に適用されるこの最終分離工程中の脂質Aから加水分解された多糖類を分離するために、ここで変更された、クロロホルム可溶性の脂質は、選択的に下層の有機に分配相。さらに、リピドAを精製するには、逆相又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーは、12を用いることができる。
全細胞由来の脂質A種の単離後、分析方法の数は、NMR、TLC及びMSベースの分析のような単離された物質の化学構造を特徴付けるために使用することができる。 NMRは非破壊構造解明を可能にし、グリコシド結合、アシル鎖位置の明確な割り当て、およびアミノアラビノースまたはホスホエタノールアミン15〜17のような脂質Aの変更のための結合部位の割り当てに関連した構造的な詳細を提供します。リピドAのNMR分析は、我々のプロトコル内で議論されていないが、別の場所15,16十分に記載されている。迅速な分析のためにTLCの方法が頻繁に使用され基づいているが、微細な化学構造に関する直接的な情報を提供することができない。 MSベースのプロトコルは、脂質A構造18,19を特徴付けるために最も頻繁に使用される方法である。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）-MSは、しばしば、最初に無傷のリピドA種を調査するために使用される。単一荷電イオンは、我々の分析物の抽出手順に従って調製から生成される。より細かい構造解析が必要とされるように、MS / MSベースの方法は、MALDI-MSのより多くの情報を証明する。単独で（ESI）をエレクトロスプレーイオン又は前駆イオンは、さらに構造的に有益な生成物イオンの18,20,21を生成するために、衝突誘起解離（CID）又は紫外光解離（UVPD）によって断片化された荷電脂質を乗算する結合されている。前駆体イオンを、脂質からニュートラルロス製品も頻繁に構造情報の追加レイヤを提供し、ESI-MSの間に生成される。
タンデム質量分析（MS / MS）は、リピドA構造の解明に不可欠で汎用性の高い方法であることが証明されている。 MS / MSの間に、イオンは、前駆イオンの構造を解明するために使用することができる診断フラグメンテーションパターンを生成するために活性化される。最も広くAVAilable MS / MS法は、CIDである。この方法は、解離を導くエネルギーの堆積をもたらす、不活性ガスをターゲットと選択された前駆イオンの衝突を介してフラグメントイオンを生成する。 CIDは細菌種22-33広範囲のリピドA構造の割り当てにおいて重要なツールであることが分かっている。
CIDは最も普遍的に実装され、MS / MS法であるが、生成物イオンの限定された配列を生成します。 193nmのUVPD代替相補MS / MS法である。この方法は、イオンを照射するレーザーを使用し、光子の吸収は、イオン解離及びその後の通電をもたらす。この高いエネルギーMS / MS技術は、CIDよりも生成物イオンのより多様なアレイを生成するため、より有益な断片化パターンを提供する。特に、UVPDはグリコシド、アミン、アシルおよびCC連動債で切断18,21,34に基づいてリピドA種の微妙な変化についての情報を与える。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、細菌の全細胞由来の脂質A種の単離を詳述し、かつ化学的に、この単離された物質を特徴付けるためにTLCまたはMSベースの分析方法を記載している。タンデム質量分析法は、生物学的化合物の新たな構造解析のための強力な戦略であり、自然の中で観察されたリピドA分子の盛装の化学的特性のために非常に貴重です。 CIDとUVPD脂質A分子のキーフィンガープリントを…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はまた、JSBにR01GM103655を付与ウェルチ財団助成F1155およびNIHによってサポートされていました衛生研究所（NIH）の国立研究所からの補助金のAI064184およびAI76322によっておよびMSTの調査に陸軍研究室からの助成金61789-MA-MURによってサポートされていました
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
References
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