Forward Genetische technieken in<em> Chlamydia trachomatis</em

Summary

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Abstract

Chlamydia trachomatis, het etiologische agens van seksueel overdraagbare ziekten en oculaire infecties, blijft weinig gekarakteriseerd door zijn ontoegevendheid experimentele transformatie met recombinant DNA. We ontwikkelden een aanpak om genetische analyses uit te voeren in C. trachomatis ondanks het gebrek aan moleculair genetische hulpmiddelen. Onze methode bestaat uit: i) chemische mutagenese om snel genereren van uitgebreide bibliotheken van genetisch gedefinieerde mutanten met verschillende fenotypes; ii) hele genoom sequencing (WGS) naar de onderliggende genetische letsels in kaart en associaties tussen gemuteerde gen (s) te vinden en.. een gemeenschappelijk fenotype;. iii) genereren van recombinante stammen door co-infectie van zoogdiercellen met mutant en wild type bacterie. Dienovereenkomstig, waren we in staat om causale verbanden tussen genotypes en fenotypes vestigen. De koppeling van chemisch-geïnduceerde gen variatie en WGS aan correlatieve genotype-fenotype associaties vast Should in grote lijnen van toepassing zijn op de grote lijst van medisch en ecologisch belangrijke micro-organismen momenteel hardnekkige naar genetische analyse.

Introduction

De obligaat intracellulaire bacterie Chlamydia trachomatis is goed voor een geschatte 2,8 miljoen genitale infecties per jaar in de Verenigde Staten (Center for Disease Control) met bijbehorende complicaties zoals bekken ontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschappen en onvruchtbaarheid (1). Chlamydia spp hebben een unieke fysiologie met een bifasische ontwikkelingscyclus uit twee vormen: de infectieuze maar niet replicerende elementaire lichaam (EB) en infectueuze maar replicatieve netvormige body (RB). Infectie begint met de bevestiging van EBS aan epitheelcellen endoctyotosis gevolgd door (2). Binnen een membraangebonden vacuole genoemd een opname, EBS differentiëren in de RB vorm, die vervolgens repliceert door binaire splijting. Halverwege de cyclus, RBS overgangen terug in EBS, die vervolgens worden uitgestoten in de extracellulaire ruimte om nieuwe serie infecties teweeg wanneer de gastheercel lyses (3).

C. trachomatis isongevoelig routine manipulatie met standaard moleculaire genetische hulpmiddelen, zoals gerichte genvervanging, transposons en transducerende fagen, die centraal in de meeste studies in bacteriële genetica hebben, is onduidelijk welke mate individuele Chlamydia genen in het ontduiken van aangeboren immuniteit , nutriënten verwerving, ontwikkelings overgangen of andere processen van belang voor het overleven van de ziekteverwekker in een eukaryotische gastheer (4). Bijgevolg is deze ziekteverwekker blijft slecht gekarakteriseerd ondanks zijn klinisch belang.

De genomen van Chlamydia spp. zijn relatief klein (~ 1 Mb) (5) met meerdere soorten en biovars gesequenced met behulp van Next Generation sequencing technologieën. Vergelijkende genoomanalyse door WGS heeft een uniek inzicht in de evolutie van Chlamydia species en hun aanpassing aan de mens (6-8) en tot op zekere hoogte heeft enige informatie verstrekt over de mogelijke functie van virulentiefactoren (9, 10). THij genetische diversiteit weergegeven door klinische isolaten niet voorziet de resolutie die nodig is om systematisch in kaart de functie van de meeste virulentiefactoren, vermoedelijk omdat mutaties in dergelijke genen zou zijn gemakkelijk geselecteerd tegen. Zonder verstorende effecten van natuurlijke selectie, mutageen-geïnduceerde gen variant, in combinatie met gedefinieerde assays die maatregel defecten in virulentie, kan het spectrum van mutaties die kunnen worden onderzocht breiden. Chemische mutagenen, in het bijzonder, zijn nuttig als ze null, voorwaardelijke, hypomorphic (verminderde functie) te genereren en hypermorphic (gain of function) allelen. Met de komst van robuuste volgende generatie genoom-sequencing technologieën, kunnen dergelijke mutaties gemakkelijk worden geïdentificeerd en in kaart gebracht. Op deze wijze kan worden sterke associaties tussen veranderingen in een gen of genetische weg en een gemeenschappelijk fenotype, waardoor de toepassing van voorwaartse genetische methoden.

Het genoom sequenties van klinische stammen geopenbaard mosaicism bussen serovars en loci van frequente recombinatie (11). Empirisch bewijs voor recombinatie werd aangetoond door de co-infectie van twee verschillende antibiotica resistente stammen en selectie van dual resistente recombinant nageslacht, die werd geopenbaard aan genetische bijdragen van beide stammen (12, 13) hebben. Aldus genetische uitwisseling tussen wild type en mutante stammen in een co-infectie instelling maakt scheiding van chemisch-geïnduceerde mutaties op te sporen het aangetaste gen dat leidt tot de waargenomen fenotype.

Hier beschrijven we een werkwijze voor genetische analyse Chlamydia basis van chemische mutagenese, WGS en een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen (14) (fig. 1) uitvoeren.

Protocol

1. Chemische mutagenese Opmerking: We vonden dat de replicatieve vorm RB ontvankelijker voor chemische mutagenese dan de EB vorm. Midden in de cyclus (tussen de 18 tot 20 hpi), RBS zijn op de grootste aantallen voorafgaand aan RB-EB overgang. Omdat Chlamydia trachomatis is een obligaat intracellulair pathogeen, kunnen de effecten van de mutagene stof op de gezondheid gastheer bacteriën herstel beperken. Vero-cellen bleken beter bestand tegen de nadelige effecten van hoge niveaus van …

Representative Results

Blootstelling aan mutageen tot insluitsels die zonder bacteriën, waarschijnlijk als gevolg van bacteriële celdood verschijnen. Kenmerkend zal serovar LGV-L2 volledig lyseren geïnfecteerde cellen binnen 48 uur na infectie, maar behandeling met mutagene kan deze cyclus uitbreiden tot> 90 h. Ongeveer 10% van de insluitingen verwachting herstellen. In onze experimenten geïnfecteerde Vero cellen behandeld met 20 mg / ml EMS tot een afname 99% in de terugwinning van infectueuze nageslacht vergeleken met onbehandelde co…

Discussion

Deze methode voldoet aan de basiseisen voor genetische analyse als het vaststelt koppeling tussen genotypes en fenotypes. Belangrijk is dat deze wordt gerealiseerd zonder de hulp van conventionele moleculaire hulpmiddelen voor recombinant DNA transformatie en insertie inactivatie van genen in bacteriën, die vaak een snelheidsbeperkende stap in de analyse van genfunctie in non-model microben.

Een cruciale stap is om klonaliteit van plaque-gezuiverde mutanten te garanderen. Kruisbesmetting me…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS)	Sigma	M0880
Cyclohexamide	Sigma	C4859-1ML
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)	Life Technologies	14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate	Sigma	D7777
Nonessential amino acids (NEAA)	Life Technologies	11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved	Lonzo	50070
Genomic DNA purification kits	Qiagen	69504
DNAzol	Life Technologies	10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit)	Invitrogen	Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument	Covaris