גישות גנטיות בקדימה<em> כלמידיה trachomatis</em
Summary
אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.
Abstract
כלמידיה trachomatis, הסוכן האטיולוגי של מחלות מין ודלקות עיניות, נשאר גרוע מאופיין בשל חוסר היכולת להשתלט לשינוי ניסיוני עם ה-DNA רקומביננטי. פתחנו גישה לבצע ניתוח גנטי בג trachomatis למרות העדר כלים גנטיים מולקולריים. השיטה שלנו כוללת: i) mutagenesis הכימי כדי לייצר במהירות ספריות מקיפות של מוטציות גנטית שהוגדרו עם פנוטיפים שונים; II) הגנום כולו רצף (WGS) למפות את הנגעים הגנטיים הבסיסיים ולמצוא את הקשר בין הגן שעבר מוטציה (ים) ו.. הפנוטיפ משותף;. III) דור של זנים רקומביננטי באמצעות שיתוף זיהום של תאי יונקים עם חיידקים מסוג מוטציה ופראיים. בהתאם לכך, היינו יכול לבסס קשרים סיבתיים בין גנוטיפים ופנוטיפים. הצימוד של וריאציה הגנטית הנגרמת כימי WGS ולהקים עמותות גנוטיפ פנוטיפ-גומלות שוLD להיות באופן כללי החל על הרשימה הגדולה של מיקרואורגניזמים חשובים מבחינה רפואית והסביבה כרגע סוררים ניתוח גנטי.
Introduction
את החשבונות המחייבים תאיים חיידק כלמידיה trachomatis עבור 2.8 מיליון זיהומים באברי המין מוערכים בדרכי בשנה בארצות הברית (מרכז לבקרת מחלות) עם משויך sequelae כגון מחלת דלקתית של אגן ירכיים, הריונות מחוץ לרחם, ובעיות פוריות (1). כלמידיה spp לי ייחודיים פיזיולוגיה עם מחזור ההתפתחותי biphasic המורכב משתי צורות: גוף היסודי המדבק אך אינם שכפול (EB) וגוף reticulate noninfectious אבל replicative (RB). זיהום מתחיל עם הקובץ המצורף של EBS לתאי האפיתל ואחרי endoctyotosis (2). בתוך vacuole קרום הנכנס נקרא הכללה, EBS להתמיין טופס RB, אשר לאחר מכן משכפל על ידי החלוקה בינארית. באמצע המחזור, מעברי RBS בחזרה לEBS, אשר לאחר מכן גורש אל תוך החלל תאי ליזום סיבובים חדשים של הידבקות כאשר lyses תא המארח (3).
trachomatis ג הואעקשן למניפולציה שגרתית עם כלים גנטיים מולקולריים סטנדרטיים, כגון החלפה ממוקדת גן, transposons, וphages transducing, שהייתה מרכזי למרבית המחקרים בגנטיקה חיידקים, לא ברור באיזו מידת הגנים כלמידיה בודדות לתרום להתחמקות מהחסינות מולדת , רכישה מזינה, מעברים התפתחותיים, או תהליכים אחרים חשובים להישרדות של הפתוגן בתוך מארח אוקריוטים (4). כתוצאה מכך, הפתוגן זה נשאר מאופיין גרוע למרות החשיבות הקלינית שלה.
את הגנום של כלמידיה spp. הם קטנים יחסית (~ 1 Mb) (5) עם מינים רבים ותוך שימוש בטכנולוגיות biovars רצף רצף של הדור הבא. ניתוח הגנום השוואתי על ידי WGS סיפקה תובנות ייחודיות לאבולוציה של מיני כלמידיה והתאמת לבני אדם (6-8) ובמידה מסוימת סיפקה כמה פרטים כמו לפונקצית הפוטנציאל של גורמים ארסיות (9, 10). Tהוא מוצג על ידי מגוון גנטי קליני מבודדים אינו מספק הרזולוציה הנדרשת כדי למפות את הפונקציה של רוב הגורמים ארסיות באופן שיטתי, יש להניח כי מוטציות בגנים אלו היו נבחרו בקלות נגד. ללא תופעות של בלבול מברירה טבעית, וריאציה גן mutagen-Induced, יחד עם מבחני שהוגדרו כי פגמים למדוד בארסיות, יכולים להרחיב את הספקטרום של מוטציות שיכולים להיות שהשתתפו בסקר. מוטגנים כימיים, בפרט, הם שימושיים כפי שהם יכולים ליצור פונקציה (מופחתת) null, מותנית, hypomorphic, וhypermorphic (רווח של פונקציה) אללים. עם הגעתו של טכנולוגיות הגנום-הדור הבא של רצף חזקים, מוטציות כאלה ניתן לזהות בקלות וממופית. באופן זה, אסוציאציות חזקות יכולות להתבצע בין מוטציות במסלול גן או גנטי ופנוטיפ משותף, מה שמאפשר את היישום של קדימה גנטיים גישות.
את רצף הגנום של זנים קליניים חשף פסיפס בserovars etween ולוקוסים של רקומבינציה תכופה (11). ראיות אמפיריות של רקומבינציה הודגמה באמצעות שיתוף הזיהום משני זנים שונים עמידים לאנטיביוטיקה ובחירת צאצאי רקומביננטי הכפול עמידים, שנחשף ליש תרומה גנטית משני הזנים (12, 13). לפיכך, מטבע גנטי בין סוג בר וזנים מוטנטים בהגדרת שיתוף זיהום מאפשר הפרדה של מוטציות המושרה כימיים כדי לאתר את הגן הפגוע שמוביל לפנוטיפ הנצפה.
כאן אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי, WGS, ומערכת להחלפת ה-DNA בתאים נגועים (14) (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
מתודולוגיה זו עומדת בדרישות הבסיסיות לניתוח גנטי כפי שקובע זיקה בין גנוטיפים ופנוטיפים. חשוב מכך, זו מושגת ללא סיוע של כלים מולקולריים קונבנציונליים לשינוי DNA רקומביננטי ואיון insertional של גנים בחיידקים, שהוא לעתים קרובות צעד הגבלת שיעור בניתוח של תפקוד גן בחיידקים אי -…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable – approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
