Ileri Genetik Yaklaşımlar<em> Chlamydia trachomatis</em
Summary
Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.
Abstract
Chlamydia trachomatis, cinsel yolla bulaşan hastalıklar ve göz enfeksiyonlarının etiyolojik ajan, rekombinant DNA ile kötü nedeniyle deneysel dönüşümü olan inatçılık için karakterize kalır. Biz C. genetik analiz gerçekleştirmek için bir yaklaşım geliştirdi moleküler genetik araçları olmamasına rağmen trachomatis. Bizim yöntemi içerir: i) hızla farklı fenotipleri ile genetik olarak tanımlanmış mutantlar kapsamlı kütüphaneleri oluşturmak için kimyasal mutagenez ii) tam genom dizileme (WGS) altta yatan genetik lezyonlar eşleştirmek için ve mutasyona uğramış gen (ler) arasındaki ilişkiyi bulmak için ve.. yaygın bir fenotip;. mutant ve yabani tip bakteri, memeli hücrelerinin ko-enfeksiyon yoluyla rekombinant suş iii) üretimi. Buna göre, genotipler ve fenotip arasındaki nedensel ilişkileri kurmayı başardık. Kimyasal kaynaklı gen varyasyonu ve WGS bir bağlantı karşılıklı genotip-fenotip ilişkilerini site kurmakld genetik analiz etmek, inatçı tıbbi ve çevre önemli mikroorganizmaların büyük listesine geniş uygulanabilir.
Introduction
Ilişkili olan ABD'de yılda yaklaşık 2.8 milyon genital sistem enfeksiyonları (Hastalık Kontrol Merkezi) sekel gibi pelvik inflamatuar hastalık, ektopik gebelik ve infertilite (1) olarak için zorunlu hücre içi bakteri Chlamydia trachomatis hesapları. Chlamydia spp benzersiz var bulaşıcı ama olmayan kopyalayan temel vücut (EB) ve bulaşıcı olmayan ama replikatif ağsı vücut (RB): iki şekilde oluşan bifazik gelişim döngüsü ile fizyolojisi. Enfeksiyon endoctyotosis (2) takip epitel hücrelerine EBS eki ile başlar. Bir membran-bağlı vakuol bir dahil olarak adlandırılan içinde, EBS sonra ikili fisyon tarafından çoğaltır RB formu, içine ayırt. Orta döngüsü olarak, RBS geçişler sonra tekrar enfeksiyon yeni tur başlatmak için hücre dışı boşluğa atılırlar EBS içine zaman konakçı hücre lysis oluşumunu (3).
C. trachomatis olanBu bakteri genetiği en çalışmalara merkezi olmuştur hedeflenen gen değiştirme, transpozonlar ve iletici faj, gibi standart moleküler genetik araçları ile rutin manipülasyon dirençli, tek tek Chlamydia genlerin doğuştan gelen bağışıklık kaçırma katkıda ölçüde belirsizdir , besin satın alma, gelişim geçişleri ya da ökaryotik ev sahibi içinde (4) patojen hayatta kalması için önemli diğer işlemler. Sonuç olarak, bu patojen klinik önemi rağmen kötü karakterize kalır.
Chlamydia spp genom. Yeni Nesil sıralama teknolojileri kullanarak sıralı birden fazla tür ve biyotipe ile (5) (~ 1 Mb) nispeten küçük. WGS tarafından Karşılaştırmalı genom analizi virülans faktörlerinin potansiyel fonksiyonu (9, 10) gibi bazı bilgiler sağlamıştır klamidya türleri ve insanlar (6-8) ve bir ölçüde kendi uyum evrimi içine benzersiz bir bakış açısı sağlamıştır. Tklinik izolatlar tarafından görüntülenen o genetik çeşitlilik, genlerde mutasyonlar kolayca karşı seçilmiş olurdu muhtemelen çünkü, sistematik en virülans faktörleri fonksiyonu eşleştirmek için gerekli çözünürlüğü sağlamaz. Virülans ölçü hataları, anket edilebilir mutasyon spektrumu genişletmek olabilir tanımlanan deneyleri ile birlikte doğal seleksiyon, mutajen bağlı gen varyasyonu, gelen karıştırıcı etkisi olmadan. Kimyasal mutajen, özellikle, onlar boş, koşullu, hypomorphic (azaltılmış fonksiyonu) oluşturabilir olarak yararlı ve hypermorphic (fonksiyon kazanç) allel vardır. Sağlam nesil genom dizileme teknolojileri gelişiyle birlikte, bu mutasyonlar kolayca tespit ve eşlenebilir. Bu şekilde, güçlü bağlantılar ileri genetik yaklaşımlar uygulama sağlayan bir gen ya da genetik mutant ve yaygın bir fenotip arasında yapılabilir.
Klinik suşlarının genom dizileri mozaik b ortayaetween serovarlar ve sık rekombinasyon (11) lokusların. Rekombinasyon ampirik kanıtlar her iki suşları genetik katkı (12, 13) için ortaya çıktı çift dayanıklı rekombinant döl, iki farklı antibiyotik dirençli suşlar ve seçim bir arada enfeksiyon ile gösterilmiştir. Böylece, bir ko-enfeksiyonu ortamda vahşi tip ve mutant suşları arasında genetik değişimi kimyasal kaynaklı mutasyon ayrılması gözlenen fenotipe yol açar etkilenen genin belirlemekte sağlar.
Burada kimyasal mutasyon, WGS ve enfekte hücre içinde DNA değiş tokuşu (14) (Şekil 1) için bir sistemine dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu genotipleri ve fenotipleri arasında bağlantı kurar gibi bu yöntem genetik analiz için temel gereksinimlerini karşılar. Önemli olarak, bu rekombinant DNA dönüşümü ve sık olmayan modeli mikroplar gen fonksiyonu analizinde bir oran-sınırlayıcı bir adımdır bakteri genleri girmeyle inaktivasyonu için geleneksel moleküler araçlar yardımı olmaksızın elde edilir.
Kritik bir adım plak-saf mutantlar klonalitesi sağlamaktır. Vahşi tip veya "tesisatçı" mutan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable – approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
