Enfoques Forward genéticos en<em> Chlamydia trachomatis</em
Summary
Se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química y la secuenciación del genoma completo. Además, un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas se describe que se puede utilizar para la cartografía genética. Este método puede ser ampliamente aplicable a los sistemas microbianos que carecen de sistemas de transformación y herramientas de genética molecular.
Abstract
Chlamydia trachomatis, el agente etiológico de las enfermedades de transmisión sexual y las infecciones oculares, sigue siendo mal caracterizado por su inflexibilidad a la transformación experimental con ADN recombinante. Hemos desarrollado un enfoque para llevar a cabo el análisis genético en C. trachomatis a pesar de la falta de herramientas de genética molecular. Nuestro método consiste en: i) la mutagénesis química para generar rápidamente amplias bibliotecas de mutantes genéticamente definidos con fenotipos distintos; ii) secuenciación del genoma completo (WGS) para asignar las lesiones genéticas subyacentes y encontrar asociaciones entre genes mutados (s) y.. un fenotipo común. iii) la generación de cepas recombinantes a través de la co-infección de células de mamíferos con bacterias mutantes y de tipo salvaje. En consecuencia, hemos sido capaces de establecer relaciones causales entre los genotipos y fenotipos. El acoplamiento de la variación genética inducida químicamente y WGS establecer asociaciones genotipo-fenotipo correlativos Should ser ampliamente aplicable a la larga lista de razones médicas y ambientalmente microorganismos importantes actualmente intratables para el análisis genético.
Introduction
La bacteria Chlamydia trachomatis cuentas intracelulares obligados para un estimado de 2,8 millones de infecciones del tracto genital por año en los Estados Unidos (Center for Disease Control) asociado con secuelas tales como la enfermedad pélvica inflamatoria, embarazo ectópico e infertilidad (1). Chlamydia spp tienen un único fisiología con un ciclo de desarrollo bifásico que consiste en dos formas: el cuerpo elemental infecciosa pero no replicante (EB) y el cuerpo reticulado no infecciosa pero replicativa (RB). La infección comienza con la unión de EBs a células epiteliales seguido de endoctyotosis (2). Dentro de una vacuola de membrana denomina una inclusión, EBS se diferencian en la forma RB, que se replica por fisión binaria. En la mitad del ciclo, las transiciones RBs de nuevo en EBS, que luego son expulsados en el espacio extracelular para iniciar nuevas rondas de infección cuando la lisis de células huésped (3).
C. trachomatis esrefractario a la manipulación de rutina con herramientas genéticas moleculares estándar, tales como el reemplazo de gen objetivo, transposones, y los fagos de transducción, que han sido central para la mayoría de los estudios en genética bacteriana, No está claro el grado en que los genes de Chlamydia individuales contribuyen a la evasión de la inmunidad innata , la adquisición de nutrientes, transiciones del desarrollo, u otros procesos importantes para la supervivencia del patógeno en un huésped eucariota (4). En consecuencia, este patógeno permanece mal caracterizado a pesar de su importancia clínica.
Los genomas de Chlamydia spp. es relativamente pequeño (~ 1 Mb) (5) con múltiples especies y biotipos secuenciados utilizando tecnologías de secuenciación de próxima generación. El análisis comparativo del genoma de WGS ha proporcionado una visión única sobre la evolución de las especies de clamidias y su adaptación a los humanos (6-8) y, en cierta medida, ha proporcionado alguna información en cuanto a la función potencial de los factores de virulencia (9, 10). Tque la diversidad genética representada por los aislados clínicos no proporciona la resolución necesaria para trazar sistemáticamente la función de la mayoría de los factores de virulencia, presumiblemente debido a las mutaciones en dichos genes se han seleccionado fácilmente contra. Sin efectos de confusión de la selección natural, la variación del gen mutágeno inducida, junto con los ensayos definidos que los defectos de medida en la virulencia, pueden ampliar el espectro de mutaciones que pueden ser objeto de reconocimiento. Mutágenos químicos, en particular, son útiles ya que pueden generar nula hypomorphic (reducción de la función), condicional, y hypermorphic (ganancia de función) alelos. Con la llegada de las tecnologías de secuenciación del genoma robustos de última generación, tales mutaciones pueden ser fácilmente identificados y mapeados. De esta manera, las asociaciones fuertes se pueden realizar entre las mutaciones en un gen o vía genética y un fenotipo común, lo que permite la aplicación de enfoques genéticos hacia adelante.
Las secuencias del genoma de cepas clínicas revelaron mosaicismo bserovares ntre y loci de recombinación frecuente (11). La evidencia empírica de recombinación se demostró a través de la co-infección de dos cepas resistentes a los antibióticos diferentes y la selección de la progenie de doble recombinante resistente, que fue revelado a tener contribuciones genéticas de ambas cepas (12, 13). Por lo tanto, el intercambio genético entre el tipo salvaje y las cepas mutantes en un entorno co-infección permite la segregación de las mutaciones inducidas químicamente para identificar el gen afectado que conduce al fenotipo observado.
Aquí se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química, WGS, y un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas (14) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta metodología cumple con los requisitos básicos para el análisis genético ya que establece la vinculación entre los genotipos y fenotipos. Es importante destacar que esto se logra sin la ayuda de herramientas moleculares convencionales para la transformación del ADN recombinante y la inactivación insercional de genes en bacterias, lo cual es a menudo un paso limitante de la velocidad en el análisis de la función de genes en los microbios no modelo.
Un paso fundamental es asegurar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
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