में फॉरवर्ड जेनेटिक प्रयास<em> क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस</em
Summary
हम रासायनिक mutagenesis के और पूरे जीनोम अनुक्रमण पर आधारित क्लैमाइडिया में आनुवांशिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन. इसके अलावा, संक्रमित कोशिकाओं के भीतर डीएनए आदान प्रदान के लिए एक प्रणाली आनुवंशिक मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वर्णित है. इस विधि परिवर्तन प्रणाली और आणविक आनुवंशिक उपकरणों की कमी माइक्रोबियल सिस्टम के लिए मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है.
Abstract
क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस, यौन संचारित रोग और नेत्र संक्रमण के हेतुकविज्ञानी, पुनः संयोजक डीएनए के साथ खराब होने के कारण प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए अपने बेअदबी करने की विशेषता बनी हुई है. हम सी में आनुवांशिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित आणविक आनुवंशिक उपकरणों की कमी के बावजूद ट्रैकोमैटिस. हमारे विधि शामिल है: i) के तेजी से अलग phenotypes के साथ आनुवंशिक रूप से परिभाषित म्यूटेंट की व्यापक पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए रासायनिक उत्परिवर्तजनन ii) पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) अंतर्निहित आनुवंशिक घावों नक्शा करने के लिए और उत्परिवर्तित जीन (एस) के बीच संघों को खोजने के लिए और.. एक आम फेनोटाइप;. उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के जीवाणु के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के सह संक्रमण के माध्यम से पुनः संयोजक उपभेदों के तीन) पीढ़ी. तदनुसार, हम जीनोटाइप और phenotypes के बीच अनौपचारिक सम्बन्ध स्थापित करने में सक्षम थे. रासायनिक प्रेरित जीन भिन्नता और WGS के युग्मन correlative जीनोटाइप-phenotype संघों मज़ा स्थापित करने के लिएld आनुवांशिक विश्लेषण के लिए वर्तमान में असभ्य चिकित्सकीय और पर्यावरण की दृष्टि से महत्वपूर्ण सूक्ष्म जीवाणुओं की बड़ी सूची के लिए मोटे तौर पर लागू हो.
Introduction
संबद्ध के साथ संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रति वर्ष एक अनुमान के अनुसार 2.8 मिलियन जननांग पथ के संक्रमण (रोग नियंत्रण के लिए केंद्र) sequelae ऐसे श्रोणि सूजन बीमारी, अस्थानिक गर्भधारण, और बांझपन (1) के रूप में के लिए लाचार intracellular जीवाणु क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस खातों. क्लैमाइडिया एसपीपी एक अद्वितीय है संक्रामक लेकिन गैर नकल प्राथमिक शरीर (ईबी) और noninfectious लेकिन replicative जालीदार शरीर (आरबी): दो रूपों से मिलकर एक Biphasic विकास चक्र के साथ शरीर क्रिया विज्ञान. संक्रमण endoctyotosis (2) के बाद उपकला कोशिकाओं को ईबीएस की कुर्की के साथ शुरू होता है. एक झिल्ली ही सीमित रिक्तिका एक शामिल किए जाने के करार के भीतर, ईबीएस तो द्विआधारी विखंडन द्वारा replicates जो आरबी रूप है, में अंतर. मध्य चक्र में, आरबीएस बदलाव वापस तो संक्रमण का नया दौर शुरू करने के लिए बाह्य अंतरिक्ष में निष्कासित कर दिया जाता है जो ईबीएस में जब मेजबान सेल lyses (3).
सी. ट्रैकोमैटिस हैऐसे जीवाणु आनुवंशिकी में सबसे अध्ययन के लिए केंद्रीय किया गया है जो लक्षित जीन प्रतिस्थापन, transposons, और transducing फगेस, के रूप में मानक आणविक आनुवंशिक उपकरण, साथ दिनचर्या हेरफेर करने के लिए आग रोक, यह जो व्यक्ति क्लैमाइडिया जीन जन्मजात उन्मुक्ति की चोरी करने के लिए योगदान करने के लिए इस हद तक स्पष्ट नहीं है , पोषक अधिग्रहण, विकास संबंधी संक्रमण, या एक यूकेरियोटिक मेजबान (4) के भीतर रोगज़नक़ के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण अन्य प्रक्रियाओं. नतीजतन, इस रोगज़नक़ अपनी नैदानिक महत्व के बावजूद खराब होती रहती है.
क्लैमाइडिया एसपीपी के जीनोम. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर अनुक्रम कई प्रजातियों और biovars साथ (5) (~ 1 एमबी) अपेक्षाकृत छोटे हैं. WGS द्वारा तुलनात्मक जीनोम विश्लेषण विषैलापन कारकों की संभावित समारोह (9, 10) के रूप में कुछ जानकारी प्रदान की गई है chlamydial प्रजातियों और मानव (6-8) और कुछ हद तक उनके अनुकूलन के विकास में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान की है. टीचिकित्सीय आइसोलेट्स द्वारा प्रदर्शित वह आनुवंशिक विविधता ऐसे जीन में उत्परिवर्तन आसानी खिलाफ चयनित किया गया होगा, शायद क्योंकि व्यवस्थित सबसे विषैलापन कारकों का कार्य नक्शा करने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान नहीं करता है. डाह में उपाय दोषों का सर्वेक्षण किया जा सकता है कि परिवर्तन के स्पेक्ट्रम का विस्तार कर सकते हैं कि परिभाषित assays के साथ युग्मित प्राकृतिक चयन, उत्परिवर्तजन प्रेरित जीन भिन्नता से confounding प्रभाव के बिना. रासायनिक उत्परिवर्तजन, विशेष रूप से, वे अशक्त, सशर्त, hypomorphic (कम समारोह) उत्पन्न कर सकते हैं के रूप में उपयोगी है, और hypermorphic (समारोह का लाभ) alleles के हैं. मजबूत अगली पीढ़ी के जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, इस तरह के म्यूटेशन की पहचान आसानी से और मैप किया जा सकता है. इस तरीके में, मजबूत संघों आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण के आवेदन को सक्षम करने, एक जीन या आनुवंशिक मार्ग में परिवर्तन और एक आम phenotype के बीच बनाया जा सकता है.
नैदानिक उपभेदों के जीनोम अनुक्रम mosaicism ख प्रगटetween serovars और लगातार पुनर्संयोजन (11) की लोकी. पुनर्संयोजन के अनुभवजन्य साक्ष्य दोनों उपभेदों से आनुवंशिक योगदान (12, 13) के लिए पता चला था जो दोहरी प्रतिरोधी पुनः संयोजक संतान के दो अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों और चयन के सह संक्रमण के माध्यम से प्रदर्शन किया गया. इस प्रकार, एक सह संक्रमण सेटिंग में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच आनुवंशिक विनिमय रासायनिक प्रेरित परिवर्तन के अलगाव मनाया फेनोटाइप की ओर जाता है कि प्रभावित जीन इंगित करने के लिए अनुमति देता है.
यहाँ हम रासायनिक उत्परिवर्तजनन, WGS, और संक्रमित कोशिकाओं के भीतर डीएनए विनिमय (14) (चित्रा 1) के लिए एक प्रणाली के आधार पर क्लैमाइडिया में आनुवांशिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह जीनोटाइप और phenotypes के बीच संबंध स्थापित करता है, के रूप में इस पद्धति को आनुवांशिक विश्लेषण के लिए बुनियादी आवश्यकताओं को पूरा करती है. महत्वपूर्ण बात, इस पुनः संयोजक डीएनए परिवर्तन और अक्सर गैर मॉडल र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
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