Vi beskriver en metode for å utføre genetiske analyser i Chlamydia basert på kjemisk mutagenese og hele genom sekvensering. I tillegg, er et system for utveksling DNA innenfor infiserte celler er beskrevet som kan anvendes for genetisk kartlegging. Denne metoden kan være bredt anvendelig på mikrobielle systemer mangler transformasjon systemer og molekylære genetiske verktøy.
Chlamydia trachomatis, den agens for seksuelt overførbare sykdommer og okulære infeksjoner, forblir dårlig karakterisert grunn av sin intractability til eksperimentell transformasjon med rekombinant DNA. Vi utviklet en tilnærming til å utføre genetiske analyser i C. trachomatis tross for mangel på molekylærgenetiske verktøy. Vår metode innebærer: i) kjemisk mutagenese å raskt generere omfattende biblioteker av genetisk definerte mutanter med forskjellige fenotyper, ii) hel-genom sekvensering (WGS) å kartlegge de underliggende genetiske lesjoner og for å finne sammenhenger mellom muterte genet (e) og.. en felles fenotype;. iii) generering av rekombinante stammer gjennom co-infeksjon i celler hos pattedyr med mutant og villtype bakterier. Følgelig kunne vi etablere årsakssammenhenger mellom genotyper og fenotyper. Koblingen av kjemikalieutløst genet variasjon og WGS å etablere korrelative genotype-fenotype assosiasjoner Should være bredt aktuelt for stor liste over medisinsk og miljømessig viktige mikroorganismer i dag vanskelige å genetisk analyse.
De obligate intracellulære bakterien Chlamydia trachomatis står for anslagsvis 2,8 millioner genitale infeksjoner per år i USA (Center for Disease Control) med tilhørende følgetilstander som bekkeninfeksjon, ektopisk svangerskap og infertilitet (1). Chlamydia spp. har en unik fysiologi med en bifasisk utviklingsmessig syklus bestående av to former: den smittsomme men ikke-replikerende elementær hoveddel (EB) og infeksiøs men replikative reticulate legeme (RB). Infeksjon begynner med å feste en EBS til epitelceller etterfulgt av endoctyotosis (2). Innenfor en membran-bundet vakuole kalles en inkludering, EBS differensiere inn i RB form, som deretter gjentak av binær fisjon. Midt i syklusen, RBS overganger tilbake til EBS, som deretter utvist i det ekstracellulære plass til å sette i gang nye runder med infeksjon når verten celle løser opp (3).
C. trachomatis erildfast til rutine manipulasjon med standard molekylærgenetiske verktøy, for eksempel målrettet genet erstatning, transposoner, og transducing phages, som har stått sentralt i de fleste studier i bakterielle genetikk, er det uklart i hvilken grad individuelle Chlamydia gener bidrar til unndragelse av medfødt immunitet , nærings oppkjøpet, utviklingsmessige overganger eller andre prosesser som er viktige for patogen overlevelse innenfor en eukaryote vert (4). Derfor forblir dette patogenet dårlig karakterisert tross for sin kliniske betydning.
Genomet hos Chlamydia SPP. er relativt liten (~ 1 Mb) (5) med flere arter og biovars sekvensert ved hjelp av neste generasjons sekvensering teknologier. Komparativ genom analyse av WGS har gitt unik innsikt i utviklingen av chlamydia-arter og deres tilpasning til mennesker (6-8) og til en viss grad har gitt noen opplysninger om den potensielle funksjon av virulens faktorer (9, 10). THan genetisk mangfold vises av kliniske isolater gir ikke den oppløsningen som kreves for å systematisk kartlegge funksjonen til de fleste virulens faktorer, antagelig fordi mutasjoner i slike gener ville ha vært lett valgt mot. Uten konfunderende effekter av naturlig utvalg, mutagene-indusert genet variasjon, kombinert med definerte analyser som måler feil i virulens, kan utvide spekteret av mutasjoner som kan kartlagt. Kjemiske mutagener, i særdeleshet, er anvendbare som de kan generere null, betinget, hypomorphic (redusert funksjon), og hypermorphic (gevinst funksjon) alleler. Med ankomsten av robuste neste generasjons genom-sekvensering teknologi, kan slike mutasjoner kan lett identifiseres og kartlegges. På denne måte kan sterke assosiasjoner foretas mellom mutasjoner i et gen eller genetisk vei og en felles fenotype, det mulig å anvende frem genetiske tilnærminger.
De genomsekvenser av kliniske stammer avslørt mosaicism between serovarer og loci av hyppige rekombinasjon (11). Empirisk bevis for rekombinasjon ble demonstrert ved koinfeksjon av to forskjellige antibiotika resistente stammer og valg av den doble motstandsdyktig rekombinant avkom, som ble avdekket for å ha genetiske bidrag fra begge stammer (12, 13). Dermed kan genetisk utveksling mellom villtype og mutant stammer i en co-infeksjon innstilling segregering av kjemisk-indusert mutasjoner for å finne den berørte genet som fører til den observerte fenotype.
Her beskriver en metode for å utføre genetisk analyse på Chlamydia basert på kjemisk mutagenese, WGS og et system for utveksling DNA innenfor infiserte celler (14) (figur 1).
Denne metodikken oppfyller grunnleggende krav til genetisk analyse som det etablerer sammenhengen mellom genotyper og fenotyper. Viktigere, hvilket oppnås uten hjelp av konvensjonelle molekylære verktøy for rekombinant DNA-transformasjon og innsettingen inaktivering av gener i bakterier, som ofte er et hastighetsbegrensende trinn i analysen av gen-funksjon i ikke-modell mikrober.
Et kritisk trinn for å sikre klonalitet av plaque-rensede mutanter. Krysskontaminering med vill type eller &q…
The authors have nothing to disclose.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
1 M NaOH | |||
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
Water (sterile, tissue culture grade) | |||
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
Ethanol (molecular biology grade) | |||
8 mM NaOH | |||
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
6-well tissue culture plates | |||
12-well tissue culture plates | |||
96-well tissue culture plates | |||
Chemical safety hood | |||
Biological safety hood | |||
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
>Dissection microscope | |||
Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |