Framåt genetiska metoder i<em> Chlamydia trachomatis</em
Summary
Vi beskriver en metod för att utföra genetisk analys i Chlamydia baserad på kemisk mutagenes och hela genomet sekvensering. Dessutom är ett system för utbyte av DNA inom infekterade celler beskrivs som kan användas för genetisk kartläggning. Denna metod kan vara i stort sett tillämpas på mikrobiella system saknar transformationssystem och molekylärgenetiska verktyg.
Abstract
Chlamydia trachomatis, det etiologiska medlet för sexuellt överförbara sjukdomar och infektioner okulära, fortfarande dåligt kännetecknas grund av dess intractability experimentell transformation med rekombinant DNA. Vi utvecklade en metod för att utföra genetisk analys i C. trachomatis trots avsaknaden av molekylärgenetiska verktyg. Vår metod innebär: i) kemisk mutagenes att snabbt generera omfattande bibliotek av genetiskt definierade mutanter med distinkta fenotyper, ii) hel-genom sekvensering (WGS) för att kartlägga de bakomliggande genetiska skador och att hitta samband mellan muterad gen (er) och.. en gemensam fenotyp,. iii) generation av rekombinanta stammar genom samtidig infektion av däggdjursceller med mutant och vildtyp bakterier. Därför kunde vi etablera orsakssamband mellan genotyper och fenotyper. Kopplingen av kemiskt inducerad gen variation och WGS att etablera korrelat genotyp-fenotyp föreningar should vara allmänt tillämplig på stora listan med medicinskt och miljömässigt viktiga mikroorganismer närvarande svårlösta för genetisk analys.
Introduction
De obligat intracellulära bakterien Chlamydia trachomatis står för uppskattningsvis 2,8 miljoner könsorgan infektioner per år i USA (Center for Disease Control) med tillhörande följdsjukdomar såsom inflammatoriska sjukdomar, ektopisk graviditet och infertilitet (1). Chlamydia spp. har en unik fysiologi med en bifasisk utvecklingscykel består av två former: den smittsamma men icke-replikerande elementarkropp (EB) och icke smittsamma men replicative reticulate kropp (RB). Infektion börjar med fastsättningen av EBS till epiteliala celler följt av endoctyotosis (2). Inom en membranbundna vacuole kallas en integration, EBS differentierar till RB formuläret, som sedan replikerar genom binär fission. Vid mitten av cykeln, RBS övergångar tillbaka till EBS, som sedan släpps ut i det extracellulära utrymmet för att påbörja nya infektioner när värdcellen lyserar (3).
C. trachomatis ärrefraktär till rutinmanipulering med vanliga molekylärgenetiska verktyg, såsom riktad genutbyte, transposoner och transducerande fager, som har varit centrala för de flesta studier i bakteriella genetik, är det oklart i vilken utsträckning enskilda Chlamydia gener bidrar till kringgående av medfödd immunitet , näringsämnen förvärv, utvecklingsmässiga övergångar, eller andra processer viktiga för patogenen överlevnad inom en eukaryot värd (4). Följaktligen är denna patogen dåligt karakteriserad trots dess kliniska betydelse.
Genom av Chlamydia spp.. är relativt liten (~ 1 Mb) (5) med flera arter och biovarer sekvenseras med nästa generations sekvensering. Jämförande genomet analys av WGS har gett en unik inblick i utvecklingen av klamydia arter och deras anpassning till människa (6-8) och i viss mån har lämnat vissa uppgifter om den potentiella funktionen av virulensfaktorer (9, 10). Than genetisk mångfald visas av kliniska isolat ger inte den upplösning som krävs för att systematiskt kartlägga funktionen hos de flesta virulensfaktorer, förmodligen eftersom mutationer i dessa gener skulle lätt ha valts emot. Utan störande effekter från naturligt urval, mutagena-inducerad gen variation, tillsammans med definierade analyser som mäter fel i virulens, kan utvidga det spektrum av mutationer som kan kartläggas. Kemiska mutagena, i synnerhet, är användbara eftersom de kan generera null, villkorligt, hypomorphic (nedsatt funktion), och hypermorphic (vinst av funktion) alleler. Med ankomsten av robusta nästa generations genomet-sekvensering teknik, kan sådana mutationer lätt identifieras och kartlagts. På detta sätt kan starka associationer göras mellan mutationer i en gen eller genetiska banan och en gemensam fenotyp, vilket möjliggör tillämpning av framåt genetiska metoder.
Genomet sekvenser av kliniska stammar avslöjade mosaicism Between serovarer och loci frekvent rekombination (11). Empiriska belägg för rekombination visades genom samtidig infektion av två olika antibiotikaresistenta stammar och urval av dubbla resistenta rekombinant avkomma, vilket avslöjades ha genetiska bidrag från båda stammarna (12, 13). Således tillåter genetiskt utbyte mellan vildtyp och muterade stammar i en co-infektion inställning segregering av kemiskt inducerade mutationer att peka ut den sjuka genen som leder till den observerade fenotypen.
Här beskriver vi en metod för att utföra genetisk analys i Chlamydia baserad på kemisk mutagenes, WGS, samt ett system för utbyte av DNA inom infekterade celler (14) (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod uppfyller de grundläggande kraven för genetisk analys eftersom det fastställer koppling mellan genotyper och fenotyper. Huvudsakligen uppnås detta utan hjälp av konventionella molekylära verktyg för rekombinant DNA-transformation och insättningsinaktivering av gener i bakterier, vilket ofta är ett hastighetsbegränsande steg i analysen av geners funktion i icke-modell mikrober.
Ett viktigt steg är att se till clonality av plackrenade mutanter. Korskontaminering med vild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
- Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable – approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
- Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
- Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
- Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
- Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
- Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
- Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
- Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
- DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
- Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
- Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
- Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
- Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
- Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
- Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).
