携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法
Summary
多くの治療用途は、体内の細胞の壁を越え薬物担体とその貨物の安全かつ効率的な輸送を必要とする。この記事では、胃腸（GI）上皮のような細胞壁を越えた薬物ナノキャリア（NCS）の輸送速度とメカニズムを評価するために確立された方法の適応を説明します。
Abstract
サブマイクロキャリア（ナノキャリアは、NCは）は、溶解性、安定性、循環時間、ターゲティング、および放出を向上させることによって薬物の効力を高める。また、体内で細胞の障壁を横断することは、介入が必要とされる組織への血液から循環と輸送への治療NCの両方の経口送達のために重要である。材料は、エンドサイトーシスによって内在細胞体を通過して輸送され、分泌される一過性の隣接するセルを連動ジャンクションの破壊、または（ii）経細胞経路を介して（I）傍細胞経路、、：携帯の壁を越えたNC輸送はによって達成される反対細胞表面（transyctosis）で。細胞の障壁を横切る送達は、輸送に関与する細胞表面マーカーに特異的に結合するターゲティング剤と治療薬またはそれらのキャリアを結合することによって容易にすることができる。ここでは、WHIのモデル細胞関門を越えて広がりとNC輸送のメカニズムを測定する方法を提供CHはトランスウェルインサートにあり、多孔質膜上に成長した胃腸の単層（GI）上皮細胞で構成されています。透過障壁の形成は経上皮電気抵抗（TEER）、対照物質の経上皮輸送、および密着結合の免疫染色を測定することによって確認される。一例として、〜200nmのポリマーのNCは、治療貨物を運び、細胞表面決定基を標的とする抗体で被覆され、使用されている。抗体または治療の貨物は、放射性同位体の追跡とラベルされたNCのために125 Iで標識されている時間の変化期間の細胞単層を介して上部チャンバーに追加されます。 NCは、細胞に関連したおよび/または下にあるチャンバに搬送を検出することができる。無料の125 Iの測定は、劣化した分を差し引くことができます。傍細胞経路は、上述したバリアパラメータNC輸送による電位の変化を測定することにより評価される。経細胞輸送iをエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス経路を調節する効果に対処することによって決定されよ。
Introduction
外部環境と内部区画の間のゲートウェイとしてのボディの行為中の細胞の障壁。これは、胃腸（GI）管および血流1-3の外部露出面を分離する上皮層の場合である。携帯の障壁はまた、血流と実質および組織や臓器の細胞成分との間のインタフェースを表す。体内でこれらの細胞障壁を横断する能力は、治療薬および診断薬の効率的な送達のために重要である1これは、血液などの肺関門、血液脳関門のような血管内皮の内側ライニングの場合である循環へと介入が必要とされる組織/器官。
治療薬または診断薬の送達を改善するために、これらの化合物は、サブミクロンナノキャリア（NCS）にロードすることができる。これらの薬物送達ビヒクルは、様々な製剤化することができる薬物の溶解性、保護、薬物動態、リリース、および代謝4,5を最適化するための化学的性質と構造。 NCはまた、治療上の処置が必要とされる2,6身体の領域への接着を容易にするために、親和性またはターゲティング部分（ 例えば、抗体、ペプチド、糖、アプタマーなど ）で官能基化することができる。携帯障壁の表面に発現決定にNCの標的化は、さらに2,6におよび/ またはこれらのライニングを横切る輸送を容易にすることができる。
選択的に2環境の間の物質の輸送の役割は、細胞層の中で、特定のユニークな機能を必要とします。一つのこのような特徴は、キャビティの内腔に面する頂端膜は、膜の形態および脂質、トランスポーター、および受容体2の組成物に関して、組織の間質に向かって配向基底膜まで変化することにより、細胞極性である。もう一つの特徴は、細胞間を必要とするjunctio隣接するセル間を接続NS。タイトジャンクションを形成するタンパク質の制御、特に接合部接着分子（JAM）、オクルディン、およびクローディン、選択的傍細胞輸送として知られている細胞、間の物質の輸送を可能にするかどうバリア機能を調節し、内腔から材料の許可通過に基底外側のスペース3。体内の細胞の障壁に多くの天然および合成の要素（白血球、分子、粒子、および薬物送達システム）の結合はのアクセスの危険なので、一過性で比較的無害またはより長期であってもよい細胞ジャンクションの開口を誘導することができバリア2,5,7-9全体の不要物。したがって、この経路は、アミンの電流または増加傍漏れに対する抵抗を減少することにより、経上皮電気抵抗（TEER）及び（本明細書傍漏れと呼ばれる）分子の受動傍細胞拡散を測定することによって評価することができる基底外側空間にRT化合物は、それぞれ5,10,11、細胞間結合の開放を示している。染色はすべての細胞周辺5,10,12の周囲に細胞-細胞境界に集中して表示される場所、これらの方法を補完するために、上記のタイトジャンクションタンパク質のいずれかは、それらの完全性を評価するために染色することができる。
あるいは、クラスリン被覆ピットやカベオラと呼ばフラスコ状の膜陥入に関連するものなどの特定の細胞表面決定基を標的とする薬物送達システムは、細胞内区画5への薬物送達のための道を提供し、エンドサイトーシスによって細胞に小胞の取り込みをトリガすることができる13。また、エンドサイトーシスは、側底側のリリースのために細胞体全体に小胞の人身売買にtransyctosis、または経細胞輸送14と呼ばれる現象を引き起こすことがあります。そのため、エンドサイトーシスの動態とメカニズムについての知識は、細胞内のAを活用するために用いることができる傍細胞経路に比べて納期の比較的安全かつ制御モードを提供していますND経薬物送達、。エンドサイトーシスの機構は、古典的経路の調節因子（クラスリンとカベオリン媒介エンドサイトーシス、およびマクロピノ）または（例えば、細胞接着分子（CAM）を介したエンドサイトーシスの場合のような）非古典的ルートに評価することができる5,13,15 。
細胞内輸送は、多くの場合、標準的なウェルまたはカバースリップで研究されているのに対し、基底外側コンパートメントの不在は、細胞極性と細胞層を横断する輸送を研究する能力を妨げる。この障害を克服するために、細胞単層を横切る輸送は、長いトランスウェルの上部（頂端）チャンバ、細胞が付着し、タイトな単層を形成する多孔性透過膜で構成され、10,11,16,17が挿入され、下部用いて研究されている（基底外側）室（ 図1）。この構成では、輸送は、で測定することができる上部チャンバーに処置を施す細胞単層とその下の多孔質膜を通って輸送を次の、そして最終的に輸送され、材料の定量化のための下部チャンバー内の媒体を収集することにより、頂端から側底方向。側底から頂端方向への輸送は、上部チャンバー5,10,12,16から下室とその後のコレクションに最初の投与によって測定することができる。上記のように様々な技術が、TEERおよび傍細胞輸送アッセイを含む、トランスウェル上で透過障壁の形成を確認するために存在する。また、細胞が培養された通気フィルタは、さらに、細胞単層モデルの検証ならびに輸送のメカニズムとして、（蛍光、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡法により）イメージング分析のために除去することができる。異なる孔サイズ、材料、および表面エリアで利用可能である膜型の選択は、種々のファクトに依存する例えば、輸送される物質または物体の大きさ、細胞型、及び撮像方法としてrsを16,18-20。トランスウェルインサートはまた、チャンバーおよび細胞表面領域のボリュームは既知の定数であり、哺乳動物のような複雑なシステムと比較して、輸送の制御された正確な定量化を容易にする。 in vivo送達に関与する多くの要因が、腸の粘液の存在を含む、せん断応力、消化酵素、免疫細胞などを排除しているが、 インビトロモデルでのこの小さな規模は、輸送に関する有用な予備情報を提供しています。
携帯障壁10,11,16,17間でのNCの輸送を研究するため、これらの方法の適応を説明するための例として、ここでは消化管上皮を通過するのNC輸送の可能性は、モデル薬物送達の通過を評価することによりモデル化した場合について説明ヒト上皮結腸直腸腺癌（のCaco-2）細胞の単層を介してシステム。この目的のためにあり、cのエルは透明であり、顕微鏡イメージングのために使用することができる0.8μmの細孔ポリエチレンテレフタレート（PET）フィルター（6.4ミリメートル直径）上で、トランスウェルインサートで培養した。透過障壁の状態がTEER、コントロール物質、アルブミン、タイトジャンクションの元素の蛍光顕微鏡可視化、オクルディンタンパク質の頂端から側底輸送を測定することによって検証される。標的ポリマーNCのモデルを100nm、非生分解性ポリスチレンナノ粒子からなる、使用される。 NCは、表面だけでは標的とする抗体との吸着または標的とする抗体の組み合わせの成分のいずれかが放射性同位元素のトレースのための125 Iで標識することができる治療貨物によってコーティングされている。選択された例では、抗体は、細胞間接着分子-1（ICAM-1）を認識し、タンパク質が細胞内および経細胞輸送oをを促進することが示されているGI上皮（および他の）細胞の表面上に発現 F薬物担体とその貨物21。カーゴは、α-ガラクトシダーゼ（α-ガラクトシダーゼ）、ファブリー病、遺伝リソソーム貯蔵障害22の治療のために使用治療用酵素である。
サイズが約200nmのコーティングされたNCのは、上のNC 125 Iは、細胞単層に関連するおよび/ または検出することができ、その後、細胞単層上に先端チャンバーに添加し、そして様々な時間にわたって37℃でインキュベートし細胞下の側底室に搬送される。無料の125 Iの追加の決定は、コーティングされたNC輸送の劣化した分と推定の減算を可能にする。経細胞輸送は、エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスの経路を調節する際の輸送の変化を調べることによって決定される輸送の機構はさらに、上述のパラメータを介して、傍細胞経路に関連する透過障壁の変化を調べることにより評価される。
ontent ">これらの方法は、完全に細胞の障壁を横切る薬物送達のための潜在性の評価を可能にする、貴重なセルラバリア·モデルに関する情報、薬物送達システムの輸送の程度と速度、およびそのような輸送の機構を提供する。Protocol
Representative Results
Discussion
上述の方法を用いて、細胞壁を越え標的NCの輸送を研究するための細胞モデルは、このような場合には血液中にGI管腔から輸送を評価することに関連したCaco-2上皮細胞を、示した例のように、確立することができる経口薬物送達システム。トランスウェルインサート中のGI上皮細胞単層の培養は、細胞透過性障壁の形成を確認するために、タイトジャンクションのTEERおよび蛍光免疫染色の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、RGのハワード·ヒューズ医学研究所と国立科学財団のフェローシップでサポートされ、資金は米国国立衛生研究所（助成R01-HL98416）および米国心臓協会（グラント09BGIA2450014）によって、SMに授与されました。
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
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