Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares
Summary
Muchas aplicaciones terapéuticas requieren un transporte seguro y eficiente de los portadores de fármacos y sus cargas a través de barreras celulares en el cuerpo. En este artículo se describe una adaptación de los métodos establecidos para evaluar la tasa y el mecanismo de transporte de nanovehículos drogas (NCS) a través de barreras celulares, tales como el tracto gastrointestinal (GI) epitelio.
Abstract
Portadores Sub-micrométricas (Nanocarriers; CN) mejorar la eficacia de los medicamentos mediante la mejora de la solubilidad, estabilidad, tiempo de circulación, la orientación, y la liberación. Además, atravesar las barreras celulares en el cuerpo es crucial tanto para la administración oral de los CN terapéuticos en la circulación y el transporte de la sangre a los tejidos, donde se necesita la intervención. NC transporte a través de barreras celulares se logra mediante: (i) la ruta paracelular, a través de la interrupción transitoria de las uniones que se entrelazan las células adyacentes, o (ii) la ruta transcelular, donde los materiales son internalizados por endocitosis, transportados a través del cuerpo celular, y secretada en la superficie de la célula opuesta (transyctosis). Entrega a través de barreras celulares puede facilitarse mediante el acoplamiento de la terapéutica o de sus portadores con agentes de direccionamiento que se unen específicamente a los marcadores de la superficie celular implicadas en el transporte. Aquí, ofrecemos métodos para medir el alcance y el mecanismo de transporte de Carolina del Norte a través de una barrera de células modelo, WHICH consta de una monocapa de gastrointestinal (GI) las células epiteliales cultivadas en una membrana porosa situada en un inserto Transwell. La formación de una barrera de permeabilidad se confirmó mediante la medición de la resistencia transepitelial eléctrica (TEER), el transporte transepitelial de una sustancia de control, y la inmunotinción de las uniones estrechas. Como un ejemplo, se utilizan 200 ~ CN polímero nm, y que llevan una carga terapéutico y están recubiertos con un anticuerpo que se dirige a un determinante de la superficie celular. El anticuerpo terapéutico o de carga se marca con 125I para el rastreo de radioisótopos y los CN marcados se añaden a la cámara superior sobre la monocapa de células durante períodos variables de tiempo. NCs asociados a las células y / o transportados a la cámara subyacente puede ser detectado. Medición de free 125 I permite la sustracción de la fracción de degradado. La ruta paracelular se evalúa mediante la determinación de cambios potenciales causados por el transporte del NC para los parámetros de barrera descritas anteriormente. Transcelular i transportes determinar examinando el efecto de la modulación de la endocitosis y transcitosis vías.
Introduction
Barreras celulares en el cuerpo actúan como una puerta de enlace entre el ambiente externo y compartimentos internos. Este es el caso para el revestimiento epitelial que separa la superficie expuesta externamente del tracto gastrointestinal (GI) y el torrente sanguíneo 1-3. Barreras celulares también representan la interfaz entre el torrente sanguíneo y el parénquima y componentes celulares de los tejidos y órganos. Este es el caso para el revestimiento endotelial interior en los vasos sanguíneos, tales como la barrera sangre-de pulmón, la barrera sangre-cerebro, etc 1 La capacidad de atravesar estas barreras celulares en el cuerpo es crucial para la entrega eficaz de los agentes terapéuticos y de diagnóstico en la circulación y tejidos / órganos donde se necesita la intervención.
Para mejorar el suministro de agentes terapéuticos o de diagnóstico, estos compuestos se pueden cargar en nanovehículos sub-micrométricos (NCS). Estos vehículos de administración de fármacos se pueden formular con una variedad dequímicas y estructuras para optimizar la solubilidad del fármaco, la protección, la farmacocinética, la liberación y el metabolismo de 4,5. CN también se puede funcionalizar con afinidad o restos de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpos, péptidos, azúcares aptámeros, etc) para facilitar la adhesión a las áreas del cuerpo donde se requiere la acción terapéutica 2,6. Focalización de los Comités Nacionales de los determinantes expresados en la superficie de las barreras celulares puede facilitar aún más el transporte en y / oa través de estos forros de 2,6.
El papel de transportar selectivamente sustancias entre dos entornos requiere ciertas características únicas entre las capas de células. Una de estas características es la polaridad celular, por lo que la membrana apical dirigida a la luz de las cavidades varía desde la membrana basolateral orientada hacia el intersticio de tejido, con respecto a la morfología de la membrana y la composición de los lípidos, transportistas y receptores 2. Otra característica implica junctio intercelularns conectan células adyacentes. La regulación de las proteínas que forman las uniones estrechas, moléculas de adhesión sobre todo de unión (mermeladas), occludins y claudins, modulan la función de barrera para permitir o no el transporte de sustancias entre las células, conocidas como el transporte paracelular, que permite el paso de materiales desde la luz a el espacio basolateral 3. La unión de muchos elementos naturales y sintéticos (leucocitos, moléculas, partículas y sistemas de administración de fármacos) a barreras celulares en el cuerpo puede inducir la apertura de células-unión, que puede ser transitoria y relativamente inocuo o más prolongada y, por lo tanto, peligroso con el acceso de sustancias no deseadas a través de la barrera 2,5,7-9. Por consiguiente, esta vía se puede evaluar mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la difusión paracelular pasiva de las moléculas (en este documento denominado fugas paracelular), por lo que la disminución de la resistencia a una corriente eléctrica o el aumento de las fugas paracelular de un INEcompuesto rt en el espacio basolateral indican apertura de los cruces de células, respectivamente 5,10,11. Para complementar estos métodos, cualquiera de las proteínas de unión estrecha enumerados anteriormente se puede teñir para evaluar su integridad, donde la tinción debe aparecer concentrada en las fronteras de célula-célula todo alrededor de la periferia de la célula 5,10,12.
Alternativamente, los sistemas de administración de fármacos que se dirigen a los determinantes específicos de la superficie celular, tales como los asociados a depresiones revestidas de clatrina o invaginaciones de membrana forma de matraz llamadas caveolas, pueden desencadenar la captación vesicular en células por endocitosis, proporcionando una vía para la administración de fármacos a los compartimentos intracelulares 5, 13. Además, la endocitosis puede conducir a tráfico de vesículas de todo el cuerpo de la célula para la liberación en el lado basolateral, un fenómeno conocido como transyctosis, o el transporte transcelular 14. Por lo tanto, el conocimiento de la cinética y el mecanismo de endocitosis puede ser utilizado para explotar un intracelularND administración de fármacos transcelular, que ofrece un modo relativamente seguro y controlado de entrega en comparación con la ruta paracelular. (Endocitosis, tales como el caso de la molécula de adhesión celular (CAM)-mediada) El mecanismo de la endocitosis se puede evaluar con moduladores de la vía clásica (clatrina y la endocitosis mediada por caveolina, y macropinocitosis) o rutas no clásicos 5,13,15 .
Considerando que el tráfico intracelular se estudia a menudo en pozos o cubreobjetos estándar, la ausencia de un compartimento basolateral se opone a la polarización celular y la capacidad de estudiar el transporte a través de capas de células. Para superar este obstáculo, el transporte a través de monocapas de células se ha estudiado durante mucho tiempo el uso de insertos Transwell 10,11,16,17, que consisten en una cámara superior (apical), una membrana permeable poroso donde las células se unen y forman una monocapa apretado, y una menor (basolateral) cámara (Figura 1). En esta configuración, el transporte se puede medir en el-apical a basolateral dirección mediante la administración de un tratamiento en la cámara superior, después del transporte a través de la monocapa de células y la membrana porosa subyacente, y finalmente recoger el medio en la cámara inferior para la cuantificación de material transportado. Transporte en la dirección basolateral a apical también se puede medir por la administración inicial a la cámara inferior y la recogida posterior de la cámara superior 5,10,12,16. Existen diversas técnicas para verificar la formación de barrera de permeabilidad en los cultivos polarizados, incluyendo la TEER y ensayos de transporte paracelular, como se describió anteriormente. Además, el filtro permeable en el que se cultivan las células se puede quitar para análisis de imágenes (por ejemplo, por fluorescencia, confocal, microscopía electrónica), como una validación adicional del modelo de monocapa celular, así como el mecanismo de transporte. La selección del tipo de membrana, que está disponible en diferentes tamaños de poros, materiales, y áreas de superficie, depende de varios factors, tales como el tamaño de las sustancias u objetos a ser transportados, tipo de célula, y el método de formación de imágenes 16,18-20. Transwell inserciones también facilitan la cuantificación controlada y precisa de transporte en comparación con los sistemas de mamíferos complejos, como volúmenes de las cámaras y el área de superficie de la célula son constantes conocidas. Mientras que se eliminan muchos factores involucrados en la entrega en vivo, incluyendo la presencia de moco intestinal, tensión de cizallamiento, enzimas digestivas, las células inmunes, etc, esta pequeña escala modelo in vitro proporciona información preliminar útil en materia de transporte.
Como ejemplo para ilustrar la adaptación de estos métodos para estudiar el transporte NC a través de barreras celulares 10,11,16,17, describimos aquí un caso en que el potencial de transporte NC a través del epitelio GI fue modelado mediante la evaluación de paso de un modelo de administración de fármacos sistema a través de una monocapa de células Caco-(2) células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humana. Para este propósito, Cells se cultivaron en insertos Transwell, en un 0,8 micras de poro de tereftalato de polietileno (PET) filtro (6,4 mm de diámetro), que es transparente y puede ser utilizado para obtener imágenes de microscopía. El estado de la barrera de permeabilidad se valida mediante la medición de la TEER, el transporte apical a basolateral de una sustancia de control, la albúmina, y la visualización microscopía de fluorescencia de un elemento de las uniones estrechas, la proteína ocludina. Se utiliza un modelo de polímero específica Carolina del Norte, que consta de 100 nm, las nanopartículas de poliestireno no biodegradables. CN están recubiertas por adsorción superficial con un anticuerpo dirigido solo o una combinación de un anticuerpo dirigido y una carga terapéutica, donde cualquiera de los componentes puede ser marcado con 125I para el rastreo de radioisótopos. En el ejemplo seleccionado, el anticuerpo reconoce molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una proteína expresada en la superficie de células epiteliales GI (y otros), células que se ha demostrado para facilitar intracelular y transcelular o transporte portadores de fármacos f y sus cargas 21. La carga es la alfa-galactosidasa (α-Gal), una enzima terapéutica utilizada para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, una enfermedad de depósito lisosomal genética 22.
Los CN recubiertos, de alrededor de 200 nm de tamaño, se añaden a la cámara apical sobre la monocapa de células y se incubaron a 37 ° C durante períodos variables de tiempo, después de lo cual 125 I en los CN puede ser detectada asociada a la monocapa de células y / o transportados a la cámara basolateral por debajo de las células. Determinación adicional de free 125 I permite la sustracción de la fracción degradada y la estimación de los transportes recubierto NC. El mecanismo de transporte se evaluó adicionalmente mediante el examen de los cambios en la permeabilidad de la barrera perteneciente a la ruta paracelular, a través de los parámetros descritos anteriormente, mientras que el transporte transcelular se determina mediante el examen de los cambios en el transporte cuando la modulación de las vías de endocitosis y transcitosis.
ontenido "> Estos métodos proporcionan información valiosa acerca de los modelos de barrera celular, el alcance y la velocidad de transporte de un sistema de administración de medicamentos, y el mecanismo de este tipo de transporte, lo que en conjunto la evaluación de las posibilidades de la administración de fármacos a través de barreras celulares.Protocol
Representative Results
Discussion
Usando los métodos discutidos más arriba, un modelo celular para el estudio de transporte de los CN dirigidos a través de barreras celulares se puede establecer, por ejemplo, el ejemplo proporcionado para Caco-2 células epiteliales, lo cual es relevante para la evaluación de transporte desde el lumen GI a la sangre en el caso de los sistemas de administración de fármacos orales. El cultivo de las monocapas de células epiteliales GI en insertos Transwell activar la medición de la TEER y fluorescencia inmunotinci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación del Instituto Médico Howard Hughes y de la Fundación Nacional de Ciencias para RG, y los fondos otorgados a SM por los Institutos Nacionales de Salud (Grant R01-HL98416) y la Asociación Americana del Corazón (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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