Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares
Summary
Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.
Abstract
Portadores Sub-micrométricas (nanocarriers; CN) aumentar a eficácia de medicamentos, melhorando a solubilidade, estabilidade, tempo de circulação, segmentação, e solte. Além disso, atravessar barreiras celulares no corpo é crucial tanto para a administração oral de CNs terapêuticos para a circulação e transporte a partir do sangue para os tecidos, onde é necessária a intervenção. NC transporte através de barreiras celulares é conseguido por: (i) a via paracelular, através de disrupção transitória das junções que interligam as células adjacentes, ou (ii) a via intracelular, onde os materiais são internalizados por endocitose, transportado através do corpo da célula e secretados na superfície da célula oposta (transyctosis). Entrega através de barreiras celulares pode ser facilitada pelo acoplamento terapêutica ou dos seus transportadores com agentes de direccionamento que se ligam especificamente a marcadores da superfície celular envolvidas no transporte. Aqui, nós fornecemos métodos para medir a extensão e mecanismo de transporte NC através de uma barreira celular modelo, which consiste em uma monocamada de gastrintestinal (GI), as células epiteliais cultivadas em uma membrana porosa localizada em um transwell insert. Formação de uma barreira de permeabilidade é confirmado pela medição da resistência transepitelial elétrica (TEER), o transporte transepitelial de uma substância de controle e imunomarcação de junções apertadas. Como um exemplo, 200 ~ CNs polímero nm são utilizados, que transportam uma carga terapêutico e são revestidos com um anticorpo que tem como alvo um determinante da superfície celular. O anticorpo ou carga terapêutico é marcado com 125I, para um rastreio de radioisótopos e CNs marcadas são adicionadas à câmara superior sobre a monocamada de células durante períodos de tempo variáveis. CNs associados para as células e / ou transportadas para a câmara subjacente pode ser detectada. Medição de livre 125 I permite a subtração da fração degradada. A via paracelular é avaliada determinando mudanças potenciais causados pelo transporte NC para os parâmetros de barreira descritos acima. Transcelular i transportes determinado, abordando o efeito de modular endocitose e transcitose caminhos.
Introduction
Barreiras celulares no corpo agir como um gateway entre o ambiente externo e compartimentos internos. Este é o caso para o forro epitelial que separa a superfície exterior exposta do tracto gastrointestinal (GI) e pela corrente sanguínea 1-3. Barreiras celulares também representar a interface entre o sangue e o parênquima e os componentes celulares de tecidos e órgãos. Este é o caso para o interior do forro endotelial nos vasos sanguíneos, tais como a barreira sangue-pulmão, a barreira sangue-cérebro, etc 1 A capacidade de ultrapassar estas barreiras celulares no corpo é crucial para a entrega eficaz dos agentes terapêuticos e de diagnóstico para a circulação e tecidos / órgãos onde é necessária intervenção.
Para melhorar a entrega de agentes terapêuticos ou de diagnóstico, estes compostos podem ser carregados em nanocarriers sub-micrométricas (CN). Estes veículos de entrega de droga pode ser formulado com uma variedade dequímicas e estruturas para otimizar a solubilidade de drogas, proteção, farmacocinética, liberação, metabolismo e 4,5. CNs também pode ser funcionalizada com afinidade ou porções de direccionamento (por exemplo, anticorpos, péptidos, aptâmeros, açúcares, etc), para facilitar a aderência às áreas do corpo em que é necessária a acção terapêutica 2,6. Segmentação de CNs para determinantes expressas na superfície de barreiras celulares podem facilitar ainda mais o transporte para dentro e / ou através destes forros 2,6.
O papel do transporte seletivamente substâncias entre dois ambientes exige certas características únicas entre as camadas de células. Uma tal característica é a polaridade da célula, pelo que a membrana apical voltada para o lúmen das cavidades varia de membrana basolateral orientada para o interstício de tecidos, no que diz respeito à morfologia e composição de lípidos, transportadores e receptores de membrana 2. Outra característica envolve junctio intercelularns conectam células adjacentes. Regulamento das proteínas que formam junções apertadas, moléculas de adesão particularmente juncional (compotas), occludins e claudinas, modular a função de barreira para permitir seletivamente ou não transporte de substâncias entre as células, conhecidas como transporte paracelular, permitindo a passagem de materiais do lúmen para o espaço basolateral 3. A ligação de vários elementos naturais e sintéticos (leucócitos, moléculas, partículas e sistemas de entrega de drogas) para barreiras celulares no corpo pode induzir a abertura de alvéolos-junção, que podem ser transiente e relativamente inócuo ou mais prolongada e, portanto, com o acesso de inseguro substâncias indesejáveis através da barreira 2,5,7-9. Por conseguinte, esta via pode ser avaliada pela medição da resistência eléctrica transepitelial (TEER) e difusão paracelular passiva de moléculas (aqui chamado vazamento paracelular), pelo que diminui a resistência à passagem da corrente eléctrica ou aumento de vazamento paracelular de um inert composto no espaço basolateral indicar abertura de junções intercelulares, respectivamente 5,10,11. Para complementar estes métodos, qualquer uma das proteínas de junção apertadas listados acima podem ser coradas para avaliar a sua integridade, em que a coloração deve aparecer concentrada nas fronteiras célula-célula toda à volta da periferia da célula 5,10,12.
Alternativamente, os sistemas de entrega de drogas que têm como alvo os determinantes da superfície celular específicos, tais como aqueles associados a poços revestidos por clatrina ou invaginações da membrana em forma de balão chamados caveolae, pode provocar absorção vesicular nas células por endocitose, proporcionando uma via para a entrega de drogas para compartimentos intracelulares 5, 13. Além disso, a endocitose pode levar ao tráfico de vesículas em todo o corpo da célula para a liberação no lado basolateral, um fenômeno conhecido como transyctosis ou transporte transcelular 14. Portanto, o conhecimento da cinética e mecanismo de endocitose podem ser utilizadas para explorar um intracelularnd entrega da droga para o espaço intracelular, o que oferece um modo relativamente seguro e controlado de entrega em comparação com a via paracelular. (Endocitose como é o caso da molécula de adesão celular (CAM) mediada) O mecanismo de endocitose podem ser avaliadas com moduladores de vias clássica (clathrin e endocitose mediada por caveolina e macropinocitose) ou rotas não-clássicos 5,13,15 .
Considerando que o tráfico intracelular é frequentemente estudados em poços de padrão ou lamelas, a ausência de um compartimento basolateral opõe polarização celular e a capacidade para estudar o transporte ao longo das camadas de células. Para superar esse obstáculo, o transporte através monocamadas de células tem sido estudada usando transwell insere 10,11,16,17, que consistem em uma câmara superior (apical), uma membrana permeável poroso onde as células unir e formar uma monocamada apertado, e um menor (basolateral) câmara (Figura 1). Nesta configuração, o transporte pode ser medido noapical-para-basolateral direcção através da administração de um tratamento para a câmara superior, na sequência de transporte, através da monocamada de células e membrana porosa subjacente, e por fim recolhendo o meio na câmara inferior de quantificação de material transportado. De transporte na direcção basolateral-para-apical, também pode ser medido por administração inicial para a câmara inferior e subsequente recolha da câmara superior 5,10,12,16. Existem várias técnicas para verificar a formação da barreira de permeabilidade em transwells, incluindo TEER e ensaios de transporte paracelular, como descrito acima. Além disso, o filtro permeável no qual as células são cultivadas, pode ser removida para análise de imagens (por exemplo, por fluorescência, confocal, microscopia electrónica), como uma validação adicional do modelo de monocamada de células, bem como o mecanismo de transporte. A selecção do tipo de membrana, que está disponível em diferentes tamanhos de poros, os materiais, e áreas de superfície, depende de vários factors como o tamanho de substâncias ou objetos a serem transportados, tipo de célula, e método de imagem 16,18-20. Transwell inserções também facilitar a quantificação controlada e precisa de transporte em comparação com sistemas de mamíferos complexos, como os volumes das câmaras e área de superfície celular são constantes conhecidas. Embora muitos fatores envolvidos na in vivo de entrega são eliminadas, incluindo a presença de muco intestinal, tensão de cisalhamento, enzimas digestivas, células do sistema imunológico, etc, esta pequena escala modelo in vitro fornece informações preliminares úteis sobre transporte.
Como exemplo para ilustrar a adaptação destes métodos para estudar o transporte NC através das barreiras celulares 10,11,16,17, descrevemos aqui um caso em que o potencial de transporte NC através do epitélio GI foi modelada por avaliar passagem de um modelo de entrega de drogas sistema através de uma monocamada de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano (Caco-2), as células. Para este fim, cvaras foram cultivados em inserções Transwell, numa poro de tereftalato 0,8 mM de polietileno (PET) de filtro (6,4 mm de diâmetro), que é transparente e pode ser usado para geração de imagens de microscopia. O estado da barreira de permeabilidade é validada medindo TEER, transporte apical-para-basolateral de uma substância de controlo, albumina, e a visualização de microscopia de fluorescência de um elemento das junções apertadas, ocludina proteína. Um modelo de polímero alvo NF é usado, consistindo de 100 nm, as nanopartículas de poliestireno não-biodegradáveis. CNs são revestidas por adsorção de superfície com um anticorpo alvo sozinho ou uma combinação de um anticorpo e uma carga alvo terapêutico, em que um ou outro componente pode ser marcado com 125I, para um rastreio de radioisótopos. No exemplo escolhido, o anticorpo reconhece molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma proteína expressa sobre a superfície de GI epitelial (e outros), as células, que foram mostrados para facilitar o transporte intracelular e o espaço intracelular transportadores de drogas e suas cargas de f 21. A carga é alfa-galactosidase (α-Gal), uma enzima terapêutica utilizada para o tratamento da doença de Fabry, uma doença de armazenamento lisossómico genético 22.
Os CNs revestidos, de cerca de 200 nm de tamanho, são adicionados à câmara de apical sobre a monocamada celular e incubados a 37 ° C durante diferentes períodos de tempo, depois do que 125 I em CNs podem ser detectados associados à monocamada de células e / ou transportada para a câmara inferior basolateral das células. Determinação adicional de 125 I livre permite a subtração da fração degradada e estimativa de transporte NC revestido. O mecanismo de transporte é avaliada por meio de análise de alterações na permeabilidade da barreira pertencente à via paracelular, através dos parâmetros descritos acima, enquanto que o transporte transcelular é determinada por análise de alterações no transporte quando modulando vias de endocitose e transcitose.
ONTEÚDO "> Esses métodos fornecem informações valiosas sobre os modelos de barreira celular, a extensão ea taxa de transporte de um sistema de entrega de drogas, eo mecanismo desse transporte, permitindo completamente avaliação do potencial de liberação de fármacos através das barreiras celulares.Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando os métodos discutidos acima, um modelo celular para estudar o transporte de CNs orientadas através das barreiras celulares pode ser estabelecida, tal como o exemplo dado para Caco-2 de células epiteliais, o que é relevante para a avaliação do transporte a partir do lúmen GI para a corrente sanguínea, no caso dos sistemas de distribuição de drogas orais. A cultura de monocamadas de células epiteliais GI em inserções transwell medição de TEER e fluorescência imunocoloração de junções apertad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto Médico Howard Hughes e da National Science Foundation para RG, e os fundos atribuídos a SM pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant R01-HL98416) e da American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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