Modeller och metoder för att utvärdera Transport av Drug Delivery System Across Cellular Hinder
Summary
Många terapeutiska tillämpningar kräver säker och effektiv transport av läkemedelsbärare och deras last över cellulära barriärer i kroppen. I denna artikel beskrivs en anpassning av etablerade metoder för att utvärdera hastigheten och mekanismen för transport av läkemedelsnanocarriers (NCS) över cellulära barriärer, såsom det gastrointestinala (GI) epiteliet.
Abstract
Under mikrometer bärare (nanocarriers, NCS) öka effekten av läkemedel genom att förbättra löslighet, stabilitet, cirkulationstiden, inriktning, och släpp. Dessutom korsar cellulära barriärer i kroppen är avgörande för både oral tillförsel av terapeutiska NCs i cirkulationen och transport från blodet till vävnaderna, där insatser behövs. NC transport över cellulära barriärer uppnås genom att: (i) den paracellulära vägen, via övergående störningar i de korsningar som interlock angränsande celler, eller (ii) den transcellulära vägen, där material internaliseras genom endocytos, transporteras över cellkroppen, och utsöndras vid den motsatta cellytan (transyctosis). Leverans över cellulära barriärer kan underlättas genom att koppla terapi eller deras bärare med riktade medel som binder specifikt till cellytan markörer som är involverade i transporten. Här ger vi metoder för att mäta omfattningen och mekanismen för NC-transport över en modell cellbarriär, vilket motsvarach består av ett monoskikt av gastrointestinala (GI) epitelceller odlas på ett poröst membran beläget i ett transwell insert. Bildandet av en permeabilitetsbarriär bekräftas genom att mäta transepithelial elektriskt motstånd (TEER), transepitelial transport av ett bekämpningsmedel, och immunfärgning av tight junctions. Som ett exempel är ~ 200 nm polymer NCs användas, vilket bär en terapeutisk last och är belagda med en antikropp som riktar sig mot en cellyte-determinant. Antikroppen eller terapeutiska lasten är märkt med 125 jag för radioisotop spårning och märkta NCs läggs till den övre kammaren över encellsskiktet för olika tidsperioder. NCs associerade till cellerna och / eller transporteras till den underliggande kammaren kan upptäckas. Mätning av fri 125 jag tillåter subtraktion av den nedbrutna fraktionen. Den paracellulära Rutten bedömas genom att eventuella förändringar orsakade av NC transport till barriär parametrar som beskrivs ovan. Transcellulär transport is bestäms genom att ta itu med effekterna av moduler endocytosis och transcytos vägar.
Introduction
Cellulära barriärer i kroppen fungerar som en brygga mellan den yttre miljön och interna fack. Detta är fallet för epitelbeklädnaden separera den externt exponerade ytan av det gastrointestinala (GI) området och blodomloppet 1-3. Cellulära barriärer utgör också gränssnittet mellan blodet och parenkymet och cellulära komponenter i vävnader och organ. Detta är fallet för det inre endotelbeklädnaden i blodkärl, såsom blod-lung barriären, blod-hjärn-barriären, etc. 1 Förmågan att korsa dessa cellulära barriärer i kroppen är av avgörande betydelse för effektiv leverans av terapeutiska och diagnostiska medel in i cirkulationen och vävnader / organ där ingripande behövs.
För att förbättra leveransen av terapeutiska eller diagnostiska medel, kan dessa föreningar laddas in i sub-mikrometernanocarriers (NCS). Dessa läkemedelsdepåer kan formuleras med en mängd olikakemiska och strukturer för att optimera läkemedels löslighet, skydd, farmakokinetik, release, och metabolism 4,5. NCs kan också funktionella affinitet eller inriktning delar (t.ex. antikroppar, peptider socker, aptamerer, etc.) för att underlätta vidhäftning till områden av kroppen där det krävs den terapeutiska verkan 2,6. Inriktning NCS till determinanter som uttrycks på ytan av cellulära barriärer kan ytterligare underlätta transport in och / eller över dessa beklädnader 2,6.
Den roll som selektivt transporterar ämnen mellan två miljöer kräver vissa unika funktioner hos cellager. En sådan funktion är cellens polaritet, varvid det apikala membranet som vetter mot lumen av kaviteterna varierar från det basolaterala membranet orienterad mot vävnad interstitium, med avseende på membranets morfologi och sammansättning av lipider, transportörer och receptorer 2. En annan funktion innebär inter Junctions anslutnings intilliggande celler. Reglering av de proteiner som bildar tight junctions, särskilt Junktional adhesionsmolekyler (sylt), occludins och claudins, modulera barriärfunktion för att selektivt tillåta eller inte transport av ämnen mellan celler, så kallade paracellulära transport, vilket gör att passagen av material från lumen till den basolaterala utrymmet 3. Bindning av många naturliga och syntetiska beståndsdelar (leukocyter, molekyler, partiklar och drug delivery system) till cellulära barriärer i kroppen kan framkalla cell-korsning öppning, som kan vara övergående och relativt ofarliga eller mer utdragen och därmed osäkra med tillgång av oönskade ämnen över barriären 2,5,7-9. Följaktligen kan bedömas denna bana genom mätning av transepitelial elektrisk resistans (TEER) och passiv paracellulär diffusion av molekyler (i fortsättningen kallad paracellulär läckage), varigenom minskad motståndskraft mot en elektrisk ström eller ökad paracellulär läckage av ett inert förening i det basolaterala utrymmet indikerar öppning av cell korsningar respektive 5,10,11. Som komplement till dessa metoder, kan några av de snäva junction protein som anges ovan färgas för att bedöma deras integritet, där färgning ska visas koncentreras vid cell-cellkantlinjer runt cellen periferin 5,10,12.
Alternativt kan läkemedelstillförselsystem som riktar sig mot specifika cellyt faktorer, såsom de som är associerade till clathrin drage gropar eller kolv-formade membran invaginations kallade caveolae, utlösa vesikulär upptag in i celler genom endocytos, vilket ger en väg för läkemedelstillförsel till intracellulära fack 5, 13. Dessutom kan endocytos leda till handel med blåsor över hela cellkroppen för övergång vid basolaterala sidan, ett fenomen som kallas transyctosis eller transcellulär transport 14. Därför kan kunskap om kinetiken och mekanismen för endocytos användas för att utnyttja intracellulära and transcellulär läkemedelsavgivning, som erbjuder ett relativt säkert och kontrollerat leveranssättet jämfört med den paracellulära vägen. Mekanismen för endocytos kan utvärderas med modulatorer av klassiska vägar (clathrin-och caveolin förmedlad endocytos, och macropinocytosis) eller icke-klassiska vägar (såsom fallet celladhesionsmolekyl (CAM)-medierad endocytos) 5,13,15 .
Av följande skäl intracellulär människohandel ofta studeras i vanliga brunnar eller täckglas, avsaknaden av en basolaterala fack utesluter cell polarisering och förmågan att studera transport över cellskikt. För att övervinna detta hinder, transport över cellmonolager har länge studerats med hjälp av transwell infogar 10,11,16,17, som består av en övre (apikala) kammare, ett poröst membran där celler fäster och bildar en tät monolager, och en lägre (basolaterala) kammare (Figur 1). I denna konfiguration kan transport mätas iapikal till basolateral riktning genom administrering av en behandling i den övre kammaren, efter transport genom cellmonoskiktet och det underliggande porösa membranet, och slutligen uppsamling av mediet i den nedre kammaren för kvantifiering av transporterat material. Transport i basolaterala-till-apikal riktning kan också mätas genom initial administrering till den nedre kammaren och efterföljande insamlingen från den övre kammaren 5,10,12,16. Olika tekniker finns för att kontrollera bildandet av permeabilitetsbarriär på transwells, inklusive TEER och paracellulär transportanalyser, såsom beskrivits ovan. Dessutom kan det permeabla filter på vilket cellerna odlas avlägsnas för bildanalys (t ex genom fluorescens, konfokalt, elektronmikroskopi), som ytterligare validering av cellmonoskiktet modell liksom mekanismen för transport. Val av membran typ, som är tillgängliga i olika porstorlekar, material och yta, beror på olika factors såsom storleken av ämnen eller föremål som skall transporteras, celltyp, och avbildningsmetod 16,18-20. Transwell skär underlättar också kontrollerad och korrekt kvantifiering av transporter jämfört med komplexa däggdjurssystem, som volymer av kamrarna och cellytan är kända konstanter. Medan många faktorer inblandade i in vivo leverans elimineras, inklusive förekomsten av tarm slem, skjuvspänning, matsmältningsenzymer, immunceller, etc., detta i liten skala in vitro-modell ger användbar preliminär information avseende transporter.
Som ett exempel för att åskådliggöra en anpassning av dessa metoder för att studera NC-transport över cellulära barriärer 10,11,16,17, beskriver vi här ett fall där potentialen för NC-transport över GI epitel modellerades genom att bedöma passage av en modell drug delivery systemet genom ett monoskikt av human epitelial kolorektal adenocarcinom (Caco-2-celler). För detta ändamål, calnar odlades i Transwell-insatser, på en 0,8 | im por polyetylentereftalat (PET)-filter (6,4 mm diameter), som är transparent och kan användas för mikroskopi avbildning. Statusen permeabilitetsbarriären valideras genom mätning TEER, apikal till basolateral transport av ett bekämpningsmedel, albumin, och fluorescensmikroskopi visualisering av en del av de tight junctions, occludin protein. En modell av riktade polymer NC används, som består av 100 nm, nonbiodegradable polystyren nanopartiklar. NCs beläggs genom ytadsorption med en målsökande antikropp för sig eller en kombination av en målstyrd antikropp, och en terapeutisk last, där endera komponenten kan märkas med 125 I för radioisotop spårning. I det valda exemplet, erkänner antikropp intercellulär adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1), ett protein som uttrycks på ytan av GI epitelial (och andra) celler, som har visats för att underlätta intracellulär och transcellulär transport o f läkemedelsbärare och deras last 21. Lasten är alfa-galaktosidas (α-Gal), en terapeutisk enzym som används för behandling av Fabrys sjukdom, en genetisk lysosomala lagring sjukdom 22.
De belagda NCS av ca 200 nm i storlek, adderas till den apikala kammaren över cellmonoskiktet och inkuberades vid 37 ° C under varierande tidsperioder, varefter 125 I på NCs kan detekteras är associerat till cellmonoskiktet och / eller transporteras till den basolaterala kammaren under cellerna. Ytterligare bestämning av fri 125I tillåter subtraktion av den nedbrutna fraktionen och uppskattning av bestruket NC transport. Mekanismen för transporten vidare utvärderas genom att undersöka förändringar i permeabilitet hinder som hänför sig till den paracellulära vägen, genom de parametrar som beskrivs ovan, medan transcellulär transporter bestäms genom att undersöka förändringar i transporten när modulerande vägar av endocytos och transcytos.
ontent "> Dessa metoder ger värdefull information om cellbarriär modeller, omfattningen och hastigheten för transport av ett drug delivery-system, och mekanismen för en sådan transport, alldeles som möjliggör utvärdering av potentialen för läkemedelstillförsel över cellulära barriärer.Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av de metoder som diskuterats ovan, kan en cellmodell för att studera transport av riktade NCs över cellulära barriärer inrättas, som i exemplet anges Caco-2 epitelceller, vilket är relevant för att bedöma transporten från GI lumen till blodet i fallet av orala läkemedel leveranssystem. Odling av GI epitelceller monolager i Transwell skär aktiverat mätning av TEER och fluorescens immunfärgning av tight junctions att bekräfta bildningen av en cell permeabilitet barriär. Därefter radiomärkning …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en gemenskap av Howard Hughes Medical Institute och National Science Foundation för att RG, och medel som tilldelats SM av National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) och American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: “Pathogen-Mimetic” systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
