كمي<em> في المختبر</em> الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت
Summary
الانضمام إلى العدلة البطانة تفعيلها في مواقع الإصابة هي جزء لا يتجزأ من استجابة المضيف للالتهابات. وصفها في هذا التقرير هو فحص ملزم العدلة التي تسمح لل<em> في المختبر</em> الكميات من العدلات الإنسان الأساسية ملزمة لخلايا بطانة الأوعية الدموية تفعيلها من خلال وسطاء التهابات في ظل ظروف ثابتة.
Abstract
البطانة الوعائية يلعب دورا أساسيا في استجابة التهابية. أثناء المرحلة الحادة من الالتهاب، ويتم تنشيط الخلايا البطانية (ECS) من خلال وسطاء المضيف أو مباشرة من قبل مكونات الميكروبية الحفظ أو جزيئات خطر المضيف المشتقة. المنشط ECS صريحة السيتوكينات، كيموكينات وجزيئات الالتصاق التي تعمل على حشد وتفعيل والاحتفاظ الكريات البيض في موقع العدوى أو الإصابة. العدلات هي أول الكريات البيض للوصول، والتمسك البطانة من خلال مجموعة متنوعة من جزيئات الالتصاق موجودة على سطوح الخلايا على حد سواء. أهم وظائف العدلات هي للقضاء على تهديدات مباشرة الميكروبية، وتعزيز تجنيد الكريات البيض الأخرى من خلال الافراج عن عوامل إضافية، والشروع في إصلاح الجرح. ولذلك، تجنيدهم والتعلق البطانة هو خطوة حاسمة في الشروع في الاستجابة الالتهابية. في هذا التقرير، وصفنا في المختبر العدلة مقايسة التصاق باستخدامcalcein AM المسمى العدلات الإنسان الأساسية ل quantitate مدى الاوعية الدموية الدقيقة تنشيط الخلايا البطانية في ظل ظروف ثابتة. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن نفس العينات quantitated بواسطة القياس الطيفي مضان يمكن أيضا تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإجراء تقييم أكثر النوعي للملزمة العدلة.
Introduction
منذ بطانة الأوعية الدموية هي في اتصال مباشر مع الدورة الدموية، وهو يقع بشكل فريد لبدء الاستجابة الالتهابية السريع خلال العدوى أو الإصابة. الخلايا البطانية (ECS) مستقبلات التعرف على نمط صريحة تعترف مجموعة متنوعة من المكونات البكتيرية الحفظ والجزيئات خطر، ومستقبلات للوسطاء المضيف التهابات مثل TNFα. تفعيل هذه المستقبلات يؤدي إلى إفراز السيتوكينات ECS (مثل IL-6، IL-8، CXCL1 وCCL2)، وupregulate جزيئات الالتصاق (على سبيل المثال E / ف selectin، VCAM-1 و ICAM-1) على سطح الخلية الخاصة بهم 1 ، 2. كل هذه الجزيئات تسهيل توطين الكريات البيض إلى مواقع الإصابة والإصابات من أجل مسح مجموعة من العوامل المعدية، والشروع في إصلاح الأنسجة 3،4. الاستجابة العدلة للإصابة ينطوي على تفاعل منسقة تنسيقا جيدا بين بطانة الأوعية الدموية والاستجابة العدلات. عند تفعيل EC، IL-8 ويفرز ويشكل التدرج داخل الأوعية الدموية على البطانة التي تسمح العدلات إلى الوطن الدخول إلى موقع العدوى أو الإصابة 5،6. E / P-selectins التوسط العدلة التقاط والمتداول من خلال الجمعيات ضعيفة نسبيا مع glycomolecules على سطح الخلية العدلة. هذه التفاعلات، جنبا إلى جنب مع IL-8 ملزم لمستقبلات لها وما شابه ذلك، وتيسير قوية، والتعلق إنتغرين بوساطة والاعتقال في نهاية المطاف من العدلات على سطح الخلية البطانية 7-10. بعد الاعتقال، يمكن العدلات تهاجر من الأوعية الدموية إلى مواقع محددة للعدوى للقضاء على مسببات الأمراض مباشرة، وتوليد الفخاخ خارج الخلية العدلات لمنع انتشار مسببات الأمراض، وتعزيز التئام الجروح والافراج عن العوامل الإضافية التي تجنيد الكريات البيض الأخرى مثل وحيدات، الضامة وشجيري الخلايا 11-17.
وصفها في هذا التقرير هو طريقة في المختبر ل quantitate التقيد العدلة لmicrovascular ECS بعد التنشيط من قبل المضيف الوسيط التهابات TNFα. تم تصميم هذا الاختبار لتقييم تفعيل ECS، وليس العدلات. العدلات الإنسان الأساسية هي الأولى في عزل باستخدام الفصل المتدرج الكثافة، ومن ثم وصفت مع calcein acetoxymethyl (AM). الاسترات داخل الخلايا الحية يتحلل calcein صباحا إلى جزيء calcein نيون للغاية مع الإثارة من 492-495 نانومتر، والانبعاثات من 513-516 نانومتر 18. ثم يتم تحضين العدلات fluorescently المسمى مع الطبقات الوحيدة EC، وتتم إزالة العدلات غير ملتصقة في وقت لاحق. ثم يقاس مضان من تبقى من العدلات، متجهة باستخدام مقياس الطيف الضوئي مضان، وتحسب كنسبة مئوية من إجمالي المدخلات مضان العدلة لكل بئر. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن العدلات منضم calcein المسمى المستخدمة في القياس الطيفي يمكن تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإعطاء مزيد من نوعي تلا من EC ACtivation. منذ يتم تنفيذ هذا الاختبار في ظل ظروف ثابتة، وسوف يتم تقييم فقط الأحداث الأولي جدا التي تحدث في تتالي التصاق الخلايا المتعادلة. ويتأكد هذا في هذا التقرير باستخدام الأجسام المضادة حجب E-selectin لإظهار أن انضمام العدلة إلى المعالجة TNFα البشرية الرئة الاوعية الدموية الدقيقة EC (HMVEC والرئة) يتم تقليل الطبقات الوحيدة جذريا عندما تعطل التفاعل مع E-selectin.
بالإضافة إلى TNFα، وقد استخدمنا بنجاح هذا الاختبار لتحديد مدى الوريد EC تفعيل السري الإنسان (HUVEC) من قبل تول مثل مستقبلات 1/2 منبهات البروتين الدهني ببتيدوغليكان المصاحب (PAL)، murein البروتين الدهني (MLP) وPam3Cys و تفعيل HMVEC والرئة بواسطة Pam3Cys 19،20. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا بنجاح هذا الاختبار مع مثبطات كيناز وبعد ضربة قاضية رني بوساطة من سطح البروتينات وحشوية في HMVEC والرئة، مما يوحي بأن هذه المنهجية هو متوافق مع مجموعة متنوعة من البيوكيميائية وscreeninز المقايسات 20. وباختصار، هذا الاختبار يوفر وسيلة سهلة الاستخدام، واستنساخه الطريقة، أكثر وظيفية للوصول إلى مدى تفعيل EC عن التهابات وسطاء في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم الخطوات الحاسمة لنجاح العدلة / الاوعية الدموية الدقيقة البطانية خلية مقايسة التصاق هي: 1) استخدام منخفض عدد مرور (<9)، والخلايا البطانية صحية؛ 2) الحفاظ على العدلات معزولة في مناطق ذات كثافة منخفضة (أي <5 × 10 6 خلايا / مل)، واستخدامها في غضون ساعتين من الع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل وزارة UCSF الرعاية تخدير والمحيطة بالجراحة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
