Quantitative<em> In vitro</em> Test pour mesurer l'adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques
Summary
L'adhésion des neutrophiles à l'endothélium activé sur les sites d'infection est une partie intégrante de la réponse inflammatoire de l'hôte. Décrite dans le présent rapport est une analyse de liaison des neutrophiles qui permet de<em> In vitro</em> Quantification des neutrophiles humains primaire liaison aux cellules endothéliales activées par des médiateurs inflammatoires dans des conditions statiques.
Abstract
L'endothélium vasculaire joue un rôle essentiel dans la réponse inflammatoire. Pendant la phase aiguë de l'inflammation, les cellules endothéliales (EC) sont activés par des médiateurs d'accueil ou directement par des composants microbiens conservés ou molécules de danger dérivées de l'hôte. Activés CEs cytokines express, des chimiokines et de molécules d'adhésion qui mobilisent, activent et conservent leucocytes au site de l'infection ou de blessure. Les neutrophiles sont les premiers leucocytes à arriver, et adhèrent à l'endothélium à travers une variété de molécules d'adhésion présentes sur les surfaces des deux cellules. Les principales fonctions des neutrophiles sont d'éliminer directement les menaces microbiennes, de promouvoir le recrutement d'autres leucocytes à travers la libération de facteurs supplémentaires, et d'initier la cicatrisation des plaies. Par conséquent, leur recrutement et leur attachement à l'endothélium est une étape critique dans l'initiation de la réponse inflammatoire. Dans ce rapport, nous décrivons un test d'adhérence in vitro en utilisant des neutrophilescalcéine AM-étiqueté neutrophiles humains primaires pour quantifier le degré d'activation des cellules endothéliales microvasculaires, en conditions statiques. Cette méthode présente l'avantage supplémentaire que les mêmes échantillons quantifiés par spectrophotométrie de fluorescence peuvent également être visualisés directement par microscopie de fluorescence pour une évaluation plus qualitative de la liaison des neutrophiles.
Introduction
Depuis l'endothélium vasculaire est en contact direct avec le sang circulant, il est situé de façon unique pour initier une réponse inflammatoire rapide lors de l'infection ou de blessure. Les cellules endothéliales (EC) expriment motif récepteurs de reconnaissance qui reconnaissent une variété de composants bactériens conservés et des molécules de danger, et les récepteurs pour les hôtes médiateurs inflammatoires telles que le TNFa. L'activation de ces récepteurs induit EC de sécréter des cytokines (par exemple IL-6, IL-8, CXCL1 et CCL2), et à réguler à la hausse des molécules d'adhésion (par exemple, E / P-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1) à leur surface cellulaire 1 , 2. Ces molécules tous facilitent la localisation des leucocytes aux sites d'infection et les blessures afin d'effacer l'hôte des agents infectieux et de lancer la réparation des tissus 3,4. La réponse des neutrophiles à l'infection implique une interaction bien coordonnée entre l'endothélium vasculaire et la réponse neutrophiles. Lors de l'activation CE, IL-8 est sécrété et forme un gradient intra-vasculaire sur l'endothélium qui permet neutrophiles à l'accueil au site de l'infection ou de blessure 5,6. E / P-sélectine médiate neutrophiles capture et rouler à travers les associations relativement faibles avec glycomolecules sur la surface des cellules neutrophiles. Ces interactions, avec liaison de l'IL-8 et de ses récepteurs apparentés, facilitent le solide, l'attachement médiée par l'intégrine et arrêt éventuel de neutrophiles à la surface des cellules endothéliales 7-10. Après l'arrestation, les neutrophiles peuvent migrer hors de la vascularisation des sites spécifiques d'infection à éliminer directement les agents pathogènes, de générer des pièges extracellulaires neutrophiles pour prévenir la propagation d'agents pathogènes, de favoriser la guérison des plaies et libérer des facteurs supplémentaires qui recrutent d'autres leucocytes tels que les monocytes, macrophages et dendritiques cellules 11-17.
Décrite dans le présent rapport est une méthode in vitro pour quantifier l'adhésion des neutrophiles à microVasculaire ECS après activation par l'hôte médiateur inflammatoire TNF. Ce test est conçu pour évaluer l'activation des EC, et non des neutrophiles. Neutrophiles humains primaires sont d'abord isolés par séparation par gradient de densité, et sont ensuite marquées à la calcéine acétoxyméthylique (AM). Estérases l'intérieur des cellules en direct hydrolyze calcéine AM à la molécule de calcéine hautement fluorescent avec une excitation de 492-495 nm et une émission de 513-516 nm 18. Les neutrophiles marquées par fluorescence sont ensuite incubés avec des monocouches CE et neutrophiles non adhérentes sont ensuite éliminés. La fluorescence des autres, les neutrophiles lié est ensuite mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence, et calculé en pour cent de l'apport total par fluorescence neutrophiles bien. Cette méthode présente l'avantage supplémentaire que les neutrophiles liés calcéine marqués utilisés en spectrophotométrie peuvent être directement visualisées par microscopie à fluorescence pour donner une plus qualitative lire des CE acvation. Depuis cet essai est effectué dans des conditions statiques, seuls les événements très initiales qui se produisent dans la cascade de l'adhésion des neutrophiles seront évalués. Ceci est confirmé dans ce rapport en utilisant des anticorps bloquants E-sélectine à montrer que l'adhésion des neutrophiles au TNFa humain poumon traité CE microvasculaire (HMVEC-Lung) monocouches est considérablement réduite lorsque l'interaction avec E-sélectine est perturbé.
En plus de TNF, nous avons utilisé avec succès ce test pour déterminer l'étendue de la veine activation humaine ombilical CE (HUVEC) par le récepteur Toll-like de 1/2 agonistes lipoprotéine associée à un peptidoglycane (PAL), murein lipoprotéine (MLP) et Pam3Cys et activation HMVEC-Lung par Pam3Cys 19,20. En outre, nous avons utilisé avec succès ce test avec les inhibiteurs de kinases et après knockdown ARNi médiée de surface et protéines cytoplasmiques dans HMVEC-Lung, ce qui suggère que cette méthode est compatible avec une variété de biochimie et screenindosages g 20. En résumé, ce test fournit une interface facile à utiliser, de façon reproductible, plus fonctionnel pour accéder à l'importance de l'activation CE par des médiateurs inflammatoires in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus importantes pour un neutrophile succès / test d'adhérence des cellules endothéliales microvasculaires sont les suivants: 1) Utilisation de faible nombre de passage (<9), les cellules endothéliales saines; 2) le maintien des neutrophiles isolés à dire <5 x 10 6 cellules de faible densité ( / ml) et de les utiliser dans les deux heures d'isolement, et 3) le lavage fastidieuse des neutrophiles calcéine AM-étiquetés et utiliser des neutrophiles calcéine AM-é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le ministère de l'UCSF des soins d'anesthésie et de soins périopératoires.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
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