כמותי<em> במבחנה</em> Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים
Summary
דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים המאפשרים<em> במבחנה</em> Quantitation של נויטרופילים אנושיים ראשוניים מחייב לתאי האנדותל מופעלים על ידי מתווכים דלקתיים בתנאים סטטיים.
Abstract
האנדותל של כלי הדם ממלא חלק בלתי נפרד בתגובה הדלקתית. בשלב החריף של דלקת, תאי האנדותל (ECs) מופעלים על ידי מתווכים מארחים או ישירות על ידי רכיבים נשמרים חיידקים או מולקולות סכנת מארח הנגזרות. ציטוקינים הופעלו ECS Express, כמוקינים ומולקולות הדבקה שיתגייסו, להפעיל ולשמור על כדוריות דם לבנות באתר של זיהום או פציעה. הנויטרופילים הם לויקוציטים הראשון שהגיע, ולדבוק האנדותל באמצעות מגוון רחב של מולקולות הדבקה בהווה על פני השטח של שני התאים. תפקידיה העיקריים של נויטרופילים הם לחסל את החיידקים ישירות איומים, לקדם הגיוס של לויקוציטים אחר דרך שחרורו של גורמים נוספים, וליזום תיקון פצע. לכן, גיוסם וההתקשרות לאנדותל הוא שלב קריטי בייזום של התגובה הדלקתית. בדו"ח זה, אנו מתארים בassay הידבקות נויטרופילים מבחנה באמצעותcalcein AM-שכותרתו נויטרופילים אנושיים עיקריים לכמת את מידת הפעלת תא אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים. לשיטה זו יתרון הנוסף שאותם הדגימות נבדקות ועל ידי ספקטרופוטומטריה הקרינה יכולות גם להיות דמיינו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי להערכה איכותית יותר של כריכת נויטרופילים.
Introduction
מאז האנדותל של כלי הדם הוא במגע ישיר עם הדם במחזור, הוא ממוקם באופן ייחודי כדי ליזום תגובה דלקתית מהירה במהלך זיהום או פציעה. תאי האנדותל (ECs) הקולטנים דפוס הכרה מפורש שמזהים מגוון רחב של רכיבים נשמרים חיידקים ומולקולות סכנה, וקולטנים למארחות מתווכים דלקתיים כגון TNFα. הפעלה של קולטנים אלה גורמת להפריש ציטוקינים ECs (למשל IL-6, IL-8, CXCL1 וCCL2), וכדי upregulate מולקולות דבק (למשל E / P-selectin, VCAM-1 וICAM-1) בתא השטח שלהם 1 , 2. מולקולות אלה כל להקל על הלוקליזציה של לויקוציטים לאתרים של זיהום ופגיעה במטרה לנקות את המארח של חומרים מזהמים וליזום תיקון רקמות 3,4. תגובת נויטרופילים לזיהום כרוכה ביחסי גומלין מתואם היטב בין האנדותל של כלי הדם ולהגיב נויטרופילים. עם הפעלת EC, IL-8 מופרש ויוצרים שיפוע intravascular על האנדותל המאפשר לבית נויטרופילים לאתר של זיהום או פגיעה 5,6. לכידת נויטרופילים E / P-selectins לתווך ומתגלגל באמצעות עמותות חלשות יחסית עם glycomolecules על פני תא נויטרופילים. אינטראקציות אלה, יחד עם IL-8 נקשרים לרצפטורים מאותו המקור שלו, להקל על התקשרות האיתנה, integrin בתיווך וסופו של דבר מעצרו של נויטרופילים על פני התא האנדותל 7-10. לאחר מעצרו, נויטרופילים יכולים לנדוד אל מחוץ לכלי דם לאתרים הספציפיים של זיהום לחסל פתוגנים ישירות, ליצור מלכודות תאי נויטרופילים כדי למנוע ההתפשטות של פתוגנים, לקדם ריפוי פצע ולשחרר גורמים נוספים שמגייסים לויקוציטים אחר כגון מונוציטים, מקרופאגים ודנדריטים תאי 11-17.
שתוארה בדוח זה הוא שיטה במבחנה לכמת דבקות נויטרופילים לmicrovascular ECS לאחר הפעלה על ידי מארח המתווך הדלקתי TNFα. assay זה נועד להעריך את ההפעלה של ECS, ולא נויטרופילים. נויטרופילים אנושיים עיקריים הם ראשון מבודדים באמצעות הפרדת שיפוע צפיפות, ולאחר מכן, שכותרתו עם calcein acetoxymethyl (PM). Esterases בתוך התאים החי Hydrolyze calcein בבוקר ועד מולקולת calcein ניאון מאוד עם עירור של 492-495 ננומטר ופליטות של 513-516 ננומטר 18. את הנויטרופילים fluorescently שהכותרת מודגרת מכן עם monolayers EC, ונויטרופילים שאינם חסיד הם הוסרו לאחר מכן. הקרינה של נויטרופילים הנותרים, כבול לאחר מכן נמדד בעזרת ספקטרופוטומטר הקרינה, ומחושבת כאחוז מקלט הקרינה נויטרופילים המוחלט בכל טוב. לשיטה זו יתרון הנוסף שנויטרופילים הכפותים calcein שכותרתו משמשים בספקטרופוטומטריה ניתן ישירות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתת איכותי יותר לקרוא מתוך EC ACtivation. מאז assay זה מתבצע בתנאים סטטיים, רק את האירועים מאוד ראשוניים המתרחשים במפל הידבקות נויטרופילים ייבחנו. זה אושר בדוח זה באמצעות נוגדנים החוסמים דואר selectin להראות כי דבקות נויטרופילים לריאות אנושית TNFα שטופל כלי הדם EC (HMVEC-ריאות) monolayers מצטמצמת באופן דרסטי כשמופרת האינטראקציה עם E-selectin.
בנוסף לTNFα, השתמשו בהצלחה assay זה כדי לקבוע את מידת הפעלת EC וריד טבור האנושית (HUVEC) על ידי הקולטן חיוג כמו אגוניסטים 1/2 ליפופרוטאין peptidoglycan קשורה (PAL), ליפופרוטאין murein (MLP) וPam3Cys ו הפעלת HMVEC-ריאות על ידי Pam3Cys 19,20. בנוסף, השתמשנו בהצלחה assay זה במעכבי קינאז, ולאחר מציאה RNAi בתיווך של פני השטח וחלבוני cytoplasmic בHMVEC-ריאות, מה שמרמז כי מתודולוגיה זו תואמת עם מגוון רחב של יוכימי וscreening מבחני 20. לסיכום, assay זה מספק דרך קלה לשימוש לשחזור, יותר פונקציונלית, כדי לגשת למידה של הפעלת EC ידי מתווכים דלקתיים במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר לנויטרופילים מוצלחים / assay הידבקות תא אנדותל כלי הדם הם: 1) שימוש במספר נמוך מעבר (<9), תאי האנדותל בריאים: 2) שמירה על נויטרופילים הבודדים בצפיפות נמוכה (כלומר <5 x 10 6 תאים כביסה ו3) השקדנית של נויטרופילים AM-שכותרתו Calcein ולהשתמש של נויטרו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד קליפורניה בסן פרנסיסקו של טיפוח הרדמה וPerioperative.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
