Cuantitativo<em> In vitro</em> Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas
Summary
Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite la<em> In vitro</em> Cuantificación de neutrófilos humana primaria unión a las células endoteliales activadas por los mediadores inflamatorios en condiciones estáticas.
Abstract
El endotelio vascular juega un papel integral en la respuesta inflamatoria. Durante la fase aguda de la inflamación, las células endoteliales (EC) se activan por los mediadores de acogida o directamente por componentes microbianos conservados peligro o moléculas derivadas del huésped. ECs activados expresan citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión que movilizan, activan y retienen los leucocitos en el sitio de la infección o lesión. Los neutrófilos son las primeras en llegar leucocitos, y se adhieren al endotelio a través de una variedad de moléculas de adhesión presentes en las superficies de ambas células. Las principales funciones de los neutrófilos son para eliminar directamente las amenazas microbianas, promover el reclutamiento de otros leucocitos a través de la liberación de factores adicionales, e iniciar la reparación de la herida. Por lo tanto, su reclutamiento y el apego al endotelio es un paso crítico en la iniciación de la respuesta inflamatoria. En este reporte se describe un ensayo in vitro de la adhesión de neutrófilos mediantecalceína AM marcada con neutrófilos humanos primarios para cuantificar el grado de activación de las células endoteliales microvasculares en condiciones estáticas. Este método tiene la ventaja adicional de que las mismas muestras se cuantificaron por espectrofotometría de fluorescencia también se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para una evaluación más cualitativa de la unión de neutrófilos.
Introduction
Dado que el endotelio vascular está en contacto directo con la sangre circulante, que tiene una ubicación única para iniciar una respuesta inflamatoria rápida durante la infección o lesión. Las células endoteliales (EC) receptores de reconocimiento de patrones expresas que reconocen una variedad de componentes bacterianos conservados y las moléculas de peligro, y los receptores para sistemas principales mediadores de la inflamación tales como TNFa. La activación de estos receptores induce ECs para secretar citoquinas (por ejemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 y CCL2), y para upregulate moléculas de adhesión (por ejemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) en su superficie celular 1 , 2. Estas moléculas de todo facilitar la localización de los leucocitos a los sitios de infección y la lesión con el fin de despejar el campo de los agentes infecciosos e iniciar la reparación del tejido 3,4. La respuesta de los neutrófilos a la infección implica una interacción bien coordinada entre el endotelio vascular y la respuesta los neutrófilos. Tras la activación CE, IL-8 se secreta y forma un gradiente intravascular en el endotelio que permite a los neutrófilos a la casa en el sitio de la infección o lesión 5,6. E / P-selectinas median la captura de neutrófilos y rodando a través de asociaciones relativamente débiles con glycomolecules en la superficie celular de neutrófilos. Estas interacciones, junto con la IL-8 la unión a sus receptores afines, facilitan la robusta, unión mediada por la integrina y la eventual detención de los neutrófilos sobre la superficie de la célula endotelial 7-10. Después de la detención, los neutrófilos pueden migrar fuera de la vasculatura a los sitios específicos de infección para eliminar directamente los patógenos, generar trampas extracelulares de neutrófilos para prevenir la propagación de los agentes patógenos, promover la cicatrización de heridas y liberar factores adicionales que reclutan otros leucocitos tales como monocitos, macrófagos y dendríticas 11-17 células.
Se describe en el presente informe es un método in vitro para cuantificar la adhesión de neutrófilos a microVascular ECs después de la activación por el mediador inflamatorio TNF anfitrión. Este ensayo está diseñado para evaluar la activación de EC, y no los neutrófilos. Los neutrófilos humanos primarios son primero aislados utilizando separación por gradiente de densidad, y luego se marcan con calceína acetoximetilo (AM). Esterasas dentro de las células en vivo hidrolizan calceína AM a la molécula calceına altamente fluorescente con una excitación de 492-495 nm y de emisión de 513-516 nm 18. Los neutrófilos marcados con fluorescencia se incuban a continuación con monocapas CE, y los neutrófilos no adherentes se eliminan posteriormente. La fluorescencia de las restantes, neutrófilos enlazados a continuación, se mide utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia, y se calcula como un porcentaje del total de entrada de la fluorescencia de neutrófilos por pocillo. Este método tiene la ventaja adicional de que los neutrófilos calceína-marcado unido utilizados en espectrofotometría se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para dar una más cualitativa lectura de CE de corriente alternavación. Puesto que este ensayo se lleva a cabo bajo condiciones estáticas, únicamente los eventos muy iniciales que se producen en la cascada de adhesión de neutrófilos serán evaluados. Esto se confirma en el informe utilizando anticuerpos bloqueantes E-selectina para mostrar que la adhesión de neutrófilos al pulmón humano TNF-tratada microvascular CE (HMVEC-pulmón) monocapas se reduce drásticamente cuando se interrumpe la interacción con E-selectina.
Además de TNFa, hemos utilizado con éxito este ensayo para determinar la extensión de la vena activación CE umbilical humana (HUVEC) por el receptor de tipo Toll medio agonistas lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) y Pam3Cys y activación HMVEC-Pulmón por Pam3Cys 19,20. Además, hemos utilizado con éxito este ensayo con inhibidores de la quinasa y después de RNAi mediada desmontables de superficie y proteínas citoplasmáticas en HMVEC-pulmón, lo que sugiere que esta metodología es compatible con una variedad de bioquímica y screeninensayos de 20 g. En resumen, este ensayo proporciona una fácil de usar, forma reproducible, más funcional para acceder a la medida de la activación de CE por mediadores inflamatorios in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes para el éxito de neutrófilos / ensayo de adhesión celular endotelial microvascular son los siguientes: 1) El uso del número de paso bajo (<9), células endoteliales sanas, 2) El mantenimiento de los neutrófilos aislados con una densidad baja (es decir, células <5 x 10 6 / ml) y el uso de ellos en las dos horas de aislamiento, y 3) el lavado Fastidious de los neutrófilos calceína AM-etiquetados y el uso de los neutrófilos calceína AM-etiquetados de manera opo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Anestesia y Cuidados perioperatorios UCSF.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | – |
References
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