Summary
Vi beskriver en analysmetod för att uppskatta livslängden för glutamat vid astrocytiska membran från elektrofysiologiska inspelningar av glutamat transportör strömmar i astrocyter.
Abstract
Den högsta tätheten av glutamat transportörer i hjärnan finns i astrocyter. Glutamat transportörer par rörelse glutamat över membranet med co-transport av 3 Na + och 1 H + och disk-transport av 1 K +. Den stökiometriska ström som genereras av transporter kan övervakas med hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter. Tidsförloppet för den inspelade strömmen formas av tidsförloppet av glutamat koncentration profilen som astrocyter utsätts, kinetiken av glutamat transportörer, och de passiva electrotonic egenskaper astrocytic membran. Här beskriver vi de experimentella och analytiska metoder som kan användas för att spela in glutamat transportör strömmar i astrocyter och isolera tidsförloppet för glutamat godkännande från alla andra faktorer som formar vågformen av astrocytiska transportör strömmar. De metoder som beskrivs här kan användas för att uppskatta livstid of flash-uncaged och synaptically-utsläppt glutamat vid astrocytiska membran i varje region i centrala nervsystemet vid hälsa och sjukdom.
Introduction
Astrocytes är en av de mest förekommande celltyper i hjärnan med stjärnformade morfologi och fina utsprång membran som sträcker sig genom hela neuropil och nå angränsande synaptic kontakter 1,2. De astrocyter 'cellmembranet är tätt packat med glutamat transportör molekyler 3. Under fysiologiska förhållanden, glutamat transportörer binder snabbt glutamat på den extracellulära sidan av membranet och överföra den till cellens cytoplasma. Genom att göra så, transportörerna upprätthålla låg den basala koncentrationen av glutamat i det extracellulära rummet 4. Glutamat transportörer i fina astrocytiska processer intill retande synapser är idealiskt positionerade för att binda glutamat frigörs under synaptiska händelser som den diffunderar bort från den synaptiska spalten. Genom att göra så, transportörerna begränsar också glutamat spillover mot peri-och extra-synaptiska regioner och på angränsande synapser, minskar den rumsliga spridningen av excitatoriska signalerer i hjärnan 5-7.
Glutamat transporter är en electrogenic process stökiometriskt kopplad till rörelsen av 3 Na + och 1 H + längs sin elektrokemiska gradient och disk-transport av en K + 8. Glutamat transporter förknippas med (men inte stökiometriskt kopplad till) en anjonisk konduktans genomsläpplig för SCN - (tiocyanat)> NO 3 - (nitrat) ≈ CIO 4 - (klorat)> I -> Br -> Cl -> F -, inte till CH 3 SO 3 - (metansulfonat) och C 6 H 11 O 7 - (glukonat) 9-11. Båda strömmar (stökiometrisk och icke-stökiometrisk) kan spelas in genom att erhålla hel-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter, visuellt identifierats enligt Dodt belysning eller infrarött differential interferens kontrast (IR-DIC) i Acute hjärnsnitt 12. Den stökiometriska komponenten i den nuvarande förknippas med glutamat transport över membranet kan isoleras med hjälp av CH 3 SO 3 - eller C 6 H 11 O 7 - baserade intracellulära lösningar och kan framkallas av flash-uncaging glutamat på astrocyter 13,14, eller genom att aktivera glutamatfrisättning från angränsande synapser, antingen elektriskt 12 eller med en riktad optogenetic kontroll.
Tidsförloppet för den stökiometriska komponenten av transportören strömmen formas av livslängden för glutamat koncentrationsprofilen på astrocytiska membran (dvs. glutamat clearance), kinetik glutamat transportörer, de passiva membran egenskaper astrocyter, och under synaptiska stimulering, vid synchronicity av glutamatfrisättning över de aktiverade synapser 13. Här beskriver vi i detalj: (1) en experimentell caoach att isolera den stökiometriska komponenten av glutamat transportör strömmar från hela-cell patch-clamp inspelningar från astrocyter med akut mus hippocampus skivor som exempel experimentell beredning, (2) ett analytiskt tillvägagångssätt att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från dessa inspelningar 13 14. Dessa metoder kan användas för att registrera och analysera glutamat transportör strömmar från astrocyter i varje region i det centrala nervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Slice Förberedelser
- Bered 500 ml skivning / lagring lösning innehållande (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 1,3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26,2 NaHCOs 3, en NaH 2 PO 4, och 22 glukos, 320 mOsm, pH 7,4
- Använd en 250 ml bägare för att förbereda en nedsänkning kammare för skivor, fyll det med 200 ml skivning / lagringslösning, värma den i ett vattenbad vid 34 ° C och bubbla det med 95% O 2, 5% CO 2.
- Håll återstående skivning / lagringslösning i en glasflaska vid 4 ° C.
- Använd en cyanoakrylatadhesiv att fästa en liten agar blocket (6%, framställd i ACSF) på vibratome provhållaren och förvara den vid 4 ° C.
- 30 minuter innan skivning, placera glasflaska innehållande skivning / lagringslösning i en hink fylld med is och bubbla det med 95% O 2, 5% CO 2.
2. Astrocyt Identifiering och Inspelningar Tre. Pharmacmiologiska Isolering av Sustained K +-ström 4. Jagtröst för förenklad Andel av synaptically-aktiverade Transporter Strömmar (fSTCs) Fem. Subtraktion av resterande zdustained K +-ström från fSTCs 6. Isolering av Flash-aktiverade Transporter Strömmar (FTCs) 7. Deconvolution analys
Obs: För att få högsta kvalitet skivor, är det viktigt att de två delarna av hjärnan är fast limmat till vibratome bottenplattan. För att göra detta använder en cyanoakrylatlim som inte är alltför flytande och som inte torkar ut för snabbt.
Obs: om allt är rättvänt, bör vibratome att skära parasagittal skivor från rygg till ventrala och från den mediala mot laterala sidan av hjärnan.
Obs: Astrocytes normalt har låg input resistance (~ 10 MQ), hyperpolariserade vila membranpotential (~ -90 mV) och ingen bränning aktivitet. De astrocyter hålls vid sin vila membran potential under experimenten i spänning-clamp-läge (dvs. hållströmmen bör läsa 0 Pa). Före varje stimulering, är en 10 ms hyperpolarizing spänningssteg (-3 mV) används för att övervaka serien och ingångsresistans av astrocyt.
Anmärkning: den TBOA-okänsliga komponenten (dvs. en som registreras i närvaro av TBOA (50-100 pM)) representerar den ihållande K +-ström. Tidsförloppet approximeras av mono-exponentiell funktion som beskrivs ovan.
Obs: I inspelningen förhållanden som beskrivs här (dvs. intracellulär CH 3 SO 3 - eller C 6 H 11 O 7 -), synaptiska stimuleringar av excitatoriska axoner genererar astrocytiska strömmar med komplexa vågformer bestående av en snabbt stigande övergående inåt stökiometrisk ström och en långsam -stigande, ihållande inåt K +-ström reflekterande K + re-jämvikt i det extracellulära utrymmet efter aktionspotential utbredning längs angränsande axoner. Det är kritiskt att avlägsna denna långvariga K +-ström, som någon restström skulle leda till enöverskatta av glutamat livstid.
Observera: Kom ihåg att analysen beskrivs i 4,7-4,10 måste utföras på den genomsnittliga spår erhållits i kontroll förhållanden och i TBOA (10 M).
Obs: i inspelningsförhållandena beskrivs här (dvs. intracellulär CH 3 SO 3 - eller C 6 H 11 O 7 -), flash stimuli generera astrocytiska strömmar som endast består av den snabbt ökande transienta stökiometriska inåt ström.
Obs: den analys som beskrivs i 6.7 måste utföras på den genomsnittliga spår erhållits i kontroll förhållanden och i TBOA (10 M).
figur 3d).
ochsom bäst beskriver den avklingande fasen av transportören ström som registreras i TBOA (10 ^ M) (figur 3b).
Observera: den funktion som beskrivs i 7.2 (dvs. H (t)) representerar tidsförloppet av glutamat clearance från astrocyter i närvaro av TBOA (10 M).
Obs: deconvolution är en matematisk operation som ingår i många paket analysprogram som (t.ex. Matlab, Python). I IgorPro, den programkod som vi normalt använder för att utföra denna typ av analys kan deconvolution verksamheten effektivt beräknas enligt nedan, med diskreta snabba Fouriertransformer. Först använder FFT operation för att beräkna discrete snabb Fourier transformen av mono-exponentialfunktion som erhölls i 7.2 och av passningen av transportören ström som registreras i TBOA erhållen i 7.1. Använd därefter IFFT operation för att beräkna den inversa diskreta snabba Fouriertransformen av förhållandet mellan de två FFT-funktionerna. Den resulterande funktionen I (t) kan beskrivas enligt följande:
Det steg som beskrivs i 7.3 tillåter härledning av filtret för transportören gällande i TBOA (10 M) (Figur 3c höger). Filtret representerar snedvridning faktorer som omvandlar livstid glutamat vid astrocytiska membran till transportören strömmen isoleras i avsnitt 4 - 6 (dvs. FSTC eller FTC).
OBS: Detta steg tillåter härledning tidsförloppet av glutamat clearance från astrocyter i kontroll förhållanden (Figur 3d höger). Antagandet bakom denna deconvolution steg är att den temporala profilen av filtret förblir oförändrat under kontroll förhållanden och i TBOA (10 M).
där G (t) är vågformen som erhållits i steg 7.1. I ekvationen ovan beskrivna, motsvarar termen t till det tidsfönster över vilken integralen beräknas.
Obs: När metoden först bildades,<t> beräknades över tidsfönster som fanns kvar otvungen 13. Denna metod kan användas så länge integrationen fönstret är satt att vara större än längden av glutamat och avslutande sönderfaller vågform helt tillbaka till baslinjen. Om detta inte är fallet, emellertid, möter denna metod för uppskattning <t> vissa begränsningar. Till exempel, om avslut vågformen inte förfalla precis tillbaka till baslinjen, sedan <t> ökar med bredden på integration fönstret. För att undvika potentiell källa för brister för uppskattning av <t>, beräknar vi nu över ett tidsfönster som motsvarar 10% av toppen av transportören nuvarande, före och efter sin debut 14. Den sistnämnda metoden förbättrar konsistensen som <t> mäts över cellerna. Detta är praktiskt särskilt när man analyserar små effekter av farmakologiska behandlingar på tidsförloppet för avslut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången för det analytiska tillvägagångssätt som här beskrivs kritiskt beroende erhålla högkvalitativa elektrofysiologiska inspelningar av transportörer strömmar från astrocyter i varje region i det centrala nervsystemet. I akuta mus hippocampus skivor, kan astrocyter lätt identifieras enligt Dodt belysning eller IR-DIC grund av deras småcellig kropp (Ø = 10 um) och framstående kärnan (figur 1). Deras utmärkande stjärnformade morfologi kan uppskattas med epifluorescence, konfokal, eller två-photon laser scanning mikroskopi, när du lägger till en fluorofor som Alexa 594 (50 ^ M) till den intracellulära lösningen, (figur 1). På elektrofysiologi nivå, astrocyter kännetecknas av låg ingång motstånd, hyperpolarized membran potential (~ -90 mV) och oförmåga att generera aktionspotentialer. Astrocytes genererar strömmar som svar på elektrisk eller optogenetic stimulering av angränsande nervceller och UV fotolys av caged föreningar som MNI-L-glutamat.
Astrocytiska transportör strömmar kan registreras med hjälp av Cs + eller K + baserade interna lösningar. Observera att Cs +, en populär K + substitut, stöder glutamat transporter men saktar glutamat transportör cykling ränta 16,17 (eftersom glutamat transportörer binder och / eller translocate Cs + över membranet långsammare än K +). Om Cs + minskar signifikant antalet transportörer tillgängliga för bindning glutamat, det leder också till mindre / långsammare transportör strömmar än de som spelats in med K + baserade interna lösningar 16,17.
Vid användning av CH 3 SO 3 - eller C 6 H 11 O 7 - som den viktigaste intracellulära anjonen, är strömmen som genereras av glutamat transportörer i astrocyter på grund av den stökiometriskt-kopplade rörelse av ett glutamat, 3 Na + och 1 K + över membranet. Denna stökiometrisk strömmen är den enda inspelade från astrocyter i fotolys experiment och vi kallar det för FTC. När du utför fotolys experiment, är det rekommenderat att alternativa UV stimuli som erhållits med ljusstrålen öppen och blockeras. Spåren som erhölls med den blockerade ljusbanan är användbara för att isolera den stimulans artefakt genereras av blixtlampan och kan subtraheras från de som erhållits med ljusbanan öppen för perfekt isolera FTC.
Den ström som registreras i astrocyter när framkalla synaptisk frisättning av glutamat har en mer komplex vågform. Den består av en snabbt ökande, övergående inåt komponenten beror på stökiometriskt-kopplade glutamat transportör ström beskrivits ovan. Dessutom innefattar det en långsamt stigande, ihållande inåt K +-ström på grund av inflöde av K + ackumuleras i det extracellulära utrymmet efter aktionspotentialenförökning längs angränsande axoner. En farmakologisk metod kan användas för att isolera transportören ström från ihållande K +-ström och kräver användning av höga koncentrationer av det breda spektrum glutamat transportör antagonist TBOA (100 iM) vid slutet av experimentet 12. Den metod som beskrivs här använder en rent analytisk metod för att isolera glutamat transportör ström från ihållande K +-ström och därmed möjliggör kortare experiment (figur 2).
Som ett första steg, interfoliera vi singel och parade-puls synaptiska stimuli (100 ms mellanrum), var 10 - 20 sek, och genomsnittet lika många svepen erhållits med singel och parade-puls stimuli. Amplituden hos den första ström framkallad av de parade stimuli bör matcha amplituden hos strömmen framkallad av den enda stimulus. Vi börjar denna analys genom att subtrahera ström framkallad av den enda stimulans från den framkallade avde parade stimuli. Denna subtraktion möjliggör isolering av svaret på den andra stimulanspaket, som också består av en snabbt ökande, övergående glutamat transportör ström och en långsamt stigande, ihållande K +-ström (Figur 2a till höger). Därefter flyttar vi svaret på den enda stimulans med ett tidsintervall som motsvarar den inter-pulsintervallet av de parade stimuli, så att tiden för starten av det gemensamma svaret stämmer tiden för starten av det andra svaret isolerats ovan (Figur 2b ). Genom att subtrahera dessa två strömningar, isolerar vi det lättare delen av transportören ström, som vi här kallar FSTC (figur 2c). Kinetiken för FSTC liknar kinetiken för synaptically-aktiverat transportör ström (Standardavtalsklausulerna) isolerad farmakologiskt med höga koncentrationer av glutamat transportör antagonisten TBOA (100 ^ M) 13. Av detta skäl och för enkelhets skull, i tidigare arbete, som avses vi till FSTCsom STC 13,14. Trots att strömmar med liknande egenskaper, fSTCs och Standardavtalsklausulerna är inte samma ström. Av denna anledning och för riktigheten i detta arbete kommer vi att hänvisa till dem explicit som fSTCs och standardavtalsklausuler. Subtraktionen här beskrivna metoden medger noggrann isolering av fSTCs i de flesta inspelningar. Men i vissa fall är en resterande ihållande K +-ström fortfarande närvarande. I detta fall är det nödvändigt att isolera den fördröjda K +-ström i olika experiment med höga koncentrationer av TBOA (50-100 pM). Tidsförloppet för farmakologiskt isolerade ihållande K +-ström kan beskrivas med ett mono-exponentiell funktion i form:
Genom att spela in astrocytiska strömmar i olika celler, uppskattar vi det genomsnittliga värdet av Τ uppgång. Vi creat nästaea mono-exponentiell funktion som den som beskrivs ovan, vari Τ upphov motsvarar det genomsnittliga värdet av Τ upphov mätt experimentellt i olika astrocyter och A motsvarar amplituden för den kvarvarande ihållande K +-ström som vi vill ta bort (figur 2d ).
Den metod som vi just beskrivit att isolera fSTCs fungerar fint när frammana glutamatfrisättning från underlätta synapser och kan också användas för att studera glutamatfrisättning från synapser som genomgår parade-puls depression. Men det är till föga nytta när glutamaterga synapser under studie inte visar någon tydlig form av kortsiktig underlättande eller depression. I detta fall kvarstår den farmakologiska isolering av transportörer strömmar med höga koncentrationer av TBOA (100 M) den mest genomförbara lösningen att isolera stökiometriskt-kopplad, synaptically-framkallade glutamat transportör ström.
(dvs. utan att blockera den helt). Målet här är att sakta ned betydligt tidsförloppet för transportören strömmen utan att förlora förmågan att skilja det från buller från inspelningarna. Det underliggande antagandet är att i närvaro av en liten koncentration av TBOA, då upptaget kapacitet astrocyter har minskat, är den viktigaste faktorn forma sönderfallet av transportören gällande den gradvisa minskningen av glutamat koncentrationen vid astrocytisk membranet 12,18. Vi passar transportören strömmen i kontroll förhållanden och i TBOA (10 M) med flera exponentialfunktion:
(Figur 3a). Vi ungefärliga glutamat clearance i TBOA (10 iM) med ett momentant-stigande funktion med mono-exponentiellt avtagande (Figur 3b) och vi deconvolve det från flera exponentialfunktion som beskriver transportören strömmen i TBOA (10 um; Figur 3c). Den resulterande vågformen är "filter", och representerar en kombination av faktorer som snedvrider (dvs. filter) glutamat koncentrationsprofilen till transportören ström (Figur 3c). Deconvolving filtret från multi-exponentiell anpassning av transportören strömmen i kontrollbetingelser tillåter uppskatta tidsförloppet för glutamat koncentrationsprofilen på inspelade astrocyt i kontrollbetingelser (figur 3d). För detta avfaltning analysen antar vi att kinetikav filtret förblir oförändrade i frånvaro och i närvaro av TBOA (10 | iM). Detta är ett rimligt antagande eftersom alla faktorer som bidrar till filtret (dvs. transportör kinetik, electrotonic filtrering och under synaptiska stimuli, asynkron frisättning av glutamat över synapser) sannolikt inte att påverkas av förekomsten av TBOA, en förening som minskar antalet av transportörer tillgängliga för bindning glutamat.
Vi använder tyngdpunkten (<t>) som ett mått på glutamat livslängd vid astrocytiska membran i olika celler. <t> Representerar "masscentrum" av clearance vågform, och är känsliga för förändringar i både stigtid och förfall glutamat clearance vågformen. Centroiden uttrycks som:
class = "jove_content"> Det finns två sätt att bestämma tidsintervallet under vilken vi kan beräkna integraler på täljare och nämnare i detta uttryck. Eftersom clearance vågformen stiger från och sönderfaller till noll, när metoden först bildades, fanns ingen specificering görs om hur man ställer integrationen fönstret, och i själva verket detta var gjort ganska löst 13. En väg runt detta problem är att begränsa integrationen fönstret till den tid det tar att nå en godtycklig del av FTC / FSTC topp, till exempel 10% 14. Denna enkla kriterium möjliggör konsekvent när du utför denna analys i olika celler, förbättrar noggrannheten i beräkningarna av <t> när clearance vågformen inte sönderfalla perfekt till noll, och förbättrar känsligheten av analysen till små skillnader i clearance vågformer som kanske förekommer i olika grupper av celler.
e 1 "fo: innehåll-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
Figur 1. Identifiering av astrocyter i akut hippocampus skivor. (Ab) Dodt bilder av hippocampus astrocyter i CA1 stratum radiatum. Under Dodt belysning och IR-DIC kan astrocyter identifieras genom sin småcellig kropp och framstående kärna. De röda pilarna pekar på flera astrocyter som kan identifieras i skivor beredningen. Den gula pilen visar astrocyt som var lappat och fylld med ett fluorescerande färgämne (se nedan). (Cd) överdrad Dodt bild av hippocampus skivor och två-photon av de lappade astrocyter, markerat med en gul pil i (ab). För detta experiment var astrocyter korrigerad och fylld med en KCH 3 SO 3 - baserad intern lösning tillsattes med Alexa 594 (50 | iM). De astrocytiska processer förlänga några tiotals um borta från than cellkropp. De anteckningar från vänster identifiera de tre viktigaste cellulära skikten av hippocampus CA1 formation som kan redovisas i skivor.
Figur 2. Isolering av fSTCs från synaptically-aktiverade transportören strömmar registreras i astrocyter. (Ac) Scheme av de analytiska steg som krävs för att isolera fSTCs från synaptically-aktiverade transportören strömmar registreras i astrocyter. (D) Analytisk metod som används för att avlägsna kvarvarande ihållande K +-ström från fSTCs (se avsnitt 5). Klicka här för att visa en större bild .
ent-width = "6.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" />
Figur 3. Deconvolution analys använts för att härleda tidsförloppet för glutamat clearance från astrocyter (a) Mono-exponentiell anpassning av FSTC / FTC isolerades i kontrollbetingelser (vänster) och i närvaro av TBOA (10 uM; höger).. (B) Tidsförloppet för glutamat clearance hos TBOA (10 | iM) approximeras med ett momentant-stigande funktion med mono-exponentiellt avtagande. (C) Deconvolving tidsförloppet för glutamat clearance hos TBOA (10 | iM) från den multi-exponentiell anpassning för transportören strömmen i TBOA (10 ^ M) tillåter uppskattning av filtret. (D) Deconvolving filtret från multi-exponentiell anpassning av transportören strömmen i kontrollbetingelser tillåter uppskatta tidsförloppet av glutamat clearance från astrocyter i styrvillkor.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en experimentell metod för att få elektrofysiologiska inspelningar från astrocyter, en analytisk protokoll för att isolera glutamat transportör strömmar i astrocyter och en matematisk metod för att härleda tidsförloppet av glutamat clearance från astrocytiska transportör strömmar.
Framgången av analysen bygger på förmågan att erhålla högkvalitativa inspelningar patch clamp från astrocyter och om riktigheten av de passande algoritmer som används för att beskriva transportören strömmarna. Den deconvolution Analysen bygger på följande två antaganden. (1) De multipla processer som snedvrider tidsförloppet av glutamat clearance i experimentellt inspelade transportör ström kan representeras som ett linjärt system. Även i absoluta tal många av de faktorer som formar transportör strömmar är icke-linjära system (i princip glutamat bindande och transport kan båda genomgå mättnad), experimentella bevis indicates att deras linjära regimen är bred. Följaktligen kvarstår tidsförloppet av transportmolekyler strömmar och av glutamat clearance densamma över ett brett spektrum av stimulans styrka, frisättning sannolikhet, och koncentrationer glutamat 13,14,18. Även om denna approximation verkar vara legitimt för våra experimentella betingelser bör det valideras innan upprepning av denna analys i olika experimentella preparat. (2) Egenskaperna hos filtret är opåverkad av närvaron av TBOA (10 | iM). Detta antagande verkar rimligt eftersom alla faktorer som bidrar till filtret (dvs. transportör kinetik, electrotonic filtrering och under synaptiska stimuli, asynkron frisättning av glutamat över synapser) sannolikt inte att påverkas av förekomsten av TBOA.
Genom att härleda glutamat clearance vågformen från fSTCs och FTCs, får vi två olika typer av information. Genom att analysera fSTCs mäter vi tiden som astrocytic membran utsätts för glutamat frisätts från synapser. Genom att frammana FTCs med fullt fält UV-belysning (dvs. genom uncaging glutamat över hela astrocytisk ytan), mäter vi tiden att astrocytiska membran utsätts för uncaged glutamat. I dessa uncaging experiment all glutamat molekyler frigörs (dvs. uncaged) på samma gång och alla transportörer är aktiverade samtidigt, med samma glutamat koncentration. Därför, genom att analysera FTCs, kan vi få en indirekt avläsning av astrocytisk glutamatupptaget kapacitet.
Det är viktigt att notera att de metoder som beskrivs här tillåter uppskatta tidsförloppet av glutamat clearance, inte det verkliga värdet av glutamat koncentrationen frammana transportören strömmarna. Den beräknade tiden Kursen är en genomsnittlig mått av tidsförloppet av glutamat avslut på samtliga områden i astrocytisk membranet som vi har elektrofysiologiska tillgång: det är ingent känslig för heterogeniteter i glutamatupptaget på olika platser inom astrocytisk membranet 19. Denna information är mer sannolikt att erhållas med högupplöst mikroskopi av glutamat-känsliga fluorescerande reportrar 20. Emellertid de för närvarande tillgängliga glutamat-känsliga reportrar uppvisar relativt smala dynamiska intervall. Detta kan införa icke-linjära förvrängningar mellan glutamat koncentrationsprofilen och fluorescenssignalen, begränsa användningen av dessa sönder för att extrahera temporal information om glutamat koncentration övergående. Därför är det förmodligen genom att kombinera alla dessa olika metoder som man kan få den mest omfattande förståelse av dynamiken i glutamaterg signaler vid astrocytic membran.
Sammanfattningsvis kan de metoder som presenteras här kan användas för att beräkna kursen clearance tid synaptically-utsläppt eller flash-uncaged glutamat vid astrocytic membran. De ger värdefulla verktyg som can användas för att uppskatta livstiden för glutamat i det extracellulära utrymmet i olika stadier av utveckling 13 i en mängd olika djurarter 14 och områden i hjärnan under fysiologiska och patologiska tillstånd 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke Interna forskningsprogram (NS002986). AS skrev manus och genomfört deconvolution analysen. JSD utvecklade den första versionen av deconvolution analys och kommenterade texten.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CGP52432 | Tocris | 1246 | |
(R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
DPCPX | Tocris | 439 | |
LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
MSOP | Tocris | 803 | |
NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C.
Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001). - Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B.
An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001). - Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).