Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay
Summary
Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.
Abstract
Biomarker werden immer wichtiger in der klinischen Entscheidungsfindung, sowie Grundlagenforschung. Diagnose Myokardinfarkt (MI) wird weitgehend durch Erfassen herz-spezifische Proteine in Patienten Serum oder Plasma als Indikator einer Myokard-Schädigung zurückzuführen. Nachdem vor kurzem gezeigt, dass Herzmyosin Protein-C (cMyBP-C) im Serum nach MI erkennbar, haben wir es als möglicher Biomarker MI vorgeschlagen. Biomarker sind in der Regel mit herkömmlichen Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assays nachgewiesen. Allerdings erfordert diese Technik eine große Probenvolumen hat einen kleinen dynamischen Bereich und kann nur ein Protein zu einem Zeitpunkt zu messen.
Hier zeigen wir, ein Multiplex-Immunoassay, bei dem drei kardialen Proteine gleichzeitig mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Messen cMyBP-C in Uniplex oder zusammen mit Creatin-Kinase MB und Troponin I zeigten eine vergleichbare Empfindlichkeit. Diese Technik nutzt die Meso-Skala Entdeckung(MSD) Verfahren zum Multiplexen in einer 96-Well-Platte mit Elektrochemilumineszenz zur Detektion kombiniert. Während nur geringe Probenvolumina benötigt werden, sind eine hohe Empfindlichkeit und einen großen dynamischen Bereich erreicht. Mit dieser Technik, maßen wir cMyBP-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I-Spiegel im Serum von 16 Patienten mit MI und verglichen die Ergebnisse mit 16 Kontrollpersonen. Wir konnten alle drei Marker in diesen Proben erkennen und fand alle drei Biomarker nach MI erhöht werden. Diese Technik ist daher geeignet für den empfindlichen Nachweis von kardialen Biomarkern im Serum.
Introduction
Die Messung von geringen Mengen an Protein in komplexen biologischen Proben, wie Serum, ist von wachsender Bedeutung für die klinische Behandlung der Patienten sowie der Grundlagenforschung. So ist ein Anstieg der Serumspiegel von kardialen Biomarkern wie Troponin I, in einer klinischen Umgebung, die mit akutem Myokardinfarkt (MI) 1. Um Proteine im Serum zu erkennen, ist Standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) die am häufigsten verwendete Technik, da sie hohe Empfindlichkeit aufweist und ermöglicht eine absolute Quantifizierung des Analyten. Jedoch erfordern herkömmliche ELISAs eine relativ große Menge der Probe (in der Regel 100 ul), haben einen hohen Hintergrundsignal in einigen biologischen Flüssigkeiten, und sind mit der Messung nur eines Analyten per ELISA 2 beschränkt.
Kürzlich wurde ein neues Immunoassay-Technik vorgestellt, umgeht viele dieser Nachteile. Diese modifizierte Assay entwickelt von MSD verwendet electrochemiluminescausübt (ECL) zur Signalerfassung, die für einen sehr niedrigen Hintergrund und eine erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht, so dass die Verwendung von kleinen Probenvolumina. Elektrochemilumineszenz ist der Reporter-Molekül Ruthenium (II) trisbipyridal, die den Nachweis-Antikörper gebunden basiert. Das Reportermolekül emittiert Licht bei 620 nm auf die elektrische Stimulation der Unterseite der Platte mit 96 Vertiefungen, die Kohlenstoff-Elektrode in ihnen 3 integriert ist. Auch durch die Verwendung Spotlackierung können mehrere Einfang-Antikörper in einer Vertiefung (bis 10 auf einer 96-Well-Platte) beschichtet, um für die gleichzeitige Quantifizierung von verschiedenen Proteinen in einer einzigen Probe 4. Diese Technik wurde kürzlich verwendet, um proinflammatorische Zytokin Profile im Serum 5,6 messen. Die Multiplex-Platten von MSD positiv auf andere Multiplex Assay-Plattformen 7 zu vergleichen.
Mit MSD als primäre Assay-Plattform, wir weiterentwickelt eine maßgeschneiderte 3 komplexe Platte, dass ceine gleichzeitig auch den Grad der kardialen Myosinbindungsprotein-C (cMyBP-C), Creatin-Kinase-MB (CK-MB) und Troponin I (cTnI), und die Ergebnisse wurden mit Monoplex Detektion cMyBP-C verglichen. CK-MB und cTnI sind gut etablierte Biomarker für MI. Allerdings kann erhöht dieser Biomarker von Krankheiten außer MI verursacht werden, z. B. Myokarditis oder Nierenversagen 8. Dies spricht für die Zugabe von zusätzlichen Biomarker, um die Spezifität des MI Diagnose zu erhöhen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass cMyBP-C ist auch ein potentieller Biomarker für MI 9. cMyBP-C ist ein dickes Filament assoziierten Protein, das in das Herz, 10-12, aber nicht in Skelett-oder glatte Muskulatur exprimiert wird. Somit ist das erhöhte Niveau der cMyBP-C in das Kreislaufsystem ein spezifischer Indikator für Herzschäden 13.
In dieser Studie verglichen wir Uniplex Erkennung cMyBP-C mit der Verwendung einer benutzerdefinierten 3-Plex Assay Serumspiegel messencMyBP-C, CK-MB und cTnI im Serum von Patienten mit MI. In Zukunft könnte diese Signatur Technik verwendet, um MI bei Patienten mit Brustschmerzen in der Notaufnahme diagnostizieren.
Die Institution Review Board (IRB) der Loyola University Chicago genehmigten die Studie für den Einsatz von deidentified humanen Proben und die Verwendung des Immunoassays (LU # 20392).
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie zeigen wir die Anwendbarkeit eines Multiplex-Immunoassay zum Nachweis von mehreren kardialen Biomarkern im Serum von Patienten. Dieses Verfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA. Zuerst wird in der ECL-Assay-Kit statt kolorimetrischen Nachweis verwendet. In ECL, stimuliert ein elektrisches Signal die lokale Produktion der gemessenen Eigenschaft (Licht), damit Entkopplung der Stimulation Ereignis aus dem Signal, das Hintergrund 14 reduziert. Dies ermöglicht eine hohe Em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom National Institutes of Health Zuschüsse R01HL105826 und K02HL114749 (Dr. Sadayappan) und American Heart Association Midwest Stipendien finanziert werden; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) und 13POST14720024 (Dr. Govindan). Die Autoren danken der Unterstützung von Dr. Jimmy Page, Jill Clampit und Dr. John Hudson, MSD, für ihre ausgezeichnete technische und Literatur Unterstützung bei der Entwicklung des Assays.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
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