Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência
Summary
Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.
Abstract
Biomarcadores são cada vez mais importante na tomada de decisão clínica, bem como a ciência básica. Diagnóstico de enfarte do miocárdio (MI) é amplamente determinado por detecção de proteínas cardíacas específicas no soro ou plasma do paciente, como um indicador de lesão do miocárdio. Tendo recentemente demonstrado que a proteína de miosina cardíaca-C (cMyBP-C) é detectável no soro após o IM, propusemos como um biomarcador potencial de MI. Os biomarcadores são tipicamente detectados por sandwich enzyme-linked immunosorbent tradicionais. No entanto, esta técnica requer um grande volume de amostra, tem uma pequena gama dinâmica e pode medir apenas uma proteína de cada vez.
Aqui, mostramos um imunoensaio multiplex no qual três proteínas cardíacas pode ser medida simultaneamente com elevada sensibilidade. Medindo cMyBP-C em Uniplex ou em conjunto com creatina quinase MB e troponina I apresentaram sensibilidade comparáveis. Esta técnica utiliza a Meso Scale Descoberta(MSD) método de multiplexação de uma placa de 96 poços juntamente com electroquimioluminescência para a detecção. Enquanto apenas pequenos volumes de amostra são necessários, elevada sensibilidade e uma grande gama dinâmica são alcançados. Usando esta técnica, medimos cMyBP-C, MB da creatina quinase e os níveis de troponina I em amostras de soro de 16 pacientes com IAM e compararam os resultados com 16 indivíduos de controle. Fomos capazes de detectar todos os três marcadores nestas amostras e encontrou os três biomarcadores para ser aumentado após o IM. Esta técnica é, portanto, adequado para a detecção sensível de marcadores cardíacos em amostras de soro.
Introduction
A medição de baixas quantidades de proteína em amostras biológicas complexas, tal como o soro, é de crescente importância para a gestão clínica do paciente, assim como a ciência básica. Por exemplo, um aumento dos níveis séricos de marcadores cardíacos, tais como a troponina I, num ambiente clínico é consistente com enfarte agudo do miocárdio (MI) 1. Para detectar proteínas em amostras de soro, padrão de ensaio imunoenzimático (ELISA), é a técnica utilizada na maioria das vezes, uma vez que tem uma elevada sensibilidade e permite a quantificação absoluta de analito. No entanto, os testes ELISA tradicionais exigem uma quantidade relativamente grande de amostra (normalmente 100 l), tem alto sinal de fundo em alguns fluidos biológicos, e são restritas para a medição de um único analito por ELISA 2.
Recentemente, uma nova técnica de imunoensaio foi introduzido que contorna muitos destes inconvenientes. Este ensaio modificado, desenvolvido pela MSD, utiliza electrochemiluminesccia (ECL) para a detecção de sinal, o que permite por um fundo muito baixo e uma sensibilidade aumentada, permitindo a utilização de pequenos volumes de amostra. Electroquimioluminescência é baseado na molécula repórter ruténio (II) trisbipyridal, que está ligado aos anticorpos de detecção. Esta molécula repórter emite luz a 620 nm após a estimulação eléctrica do fundo da placa de 96 poços, que tem eléctrodos de carbono integrados neles 3. Além disso, por meio de revestimento local, os anticorpos de captura múltiplas podem ser revestidos para um poço (até 10 numa placa de 96 poços), permitindo a quantificação simultânea de proteínas diferentes numa única amostra 4. Esta técnica tem sido recentemente usado para medir perfis de citoquinas pró-inflamatórias em soro 5,6. As placas de multiplex MSD comparam favoravelmente com outras plataformas de ensaio multiplex 7.
Usando MSD como a plataforma de ensaio primário, desenvolvemos mais uma custom made placa 3-plex que cuma quantificar simultaneamente o nível de ligação às proteínas miosina cardíaca-C (cMyBP-C), creatina-quinase MB (CK-MB) e troponina I (cTnI), e os resultados foram comparados com detecção Monoplex de cMyBP-C. CK-MB e cTnI são biomarcadores bem estabelecidos para MI. No entanto, os aumentos destes biomarcadores pode ser causada por outras patologias que MI, por exemplo miocardite ou insuficiência renal 8. Isto argumenta a favor da adição de biomarcadores adicionais para aumentar a especificidade do diagnóstico de EM. Mostrámos recentemente que cMyBP-C é também um biomarcador potencial de MI 9. cMyBP-C é uma proteína associada filamento grosso que é expresso no coração, 10-12, mas não nos músculos esqueléticos ou lisa. Assim, o aumento do nível de cMyBP-C no sistema circulatório é um indicador específico de danos cardíacos 13.
Neste estudo, comparou-se a detecção de Uniplex cMyBP-C com a utilização de um ensaio de 3-Plex personalizado para medir os níveis séricos decMyBP-C, CK-MB e cTnI no soro de pacientes com MI. No futuro, esta técnica de assinatura pode ser usado para diagnosticar MI em pacientes com dor torácica na sala de emergência.
O conselho de revisão institucional (IRB), da Loyola University Chicago aprovou o estudo para o uso de amostras humanas deidentified eo uso do imunoensaio (LU # 20392).
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, mostra a aplicabilidade de um imunoensaio multiplex para a detecção de múltiplos marcadores cardíacos no soro de pacientes. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre ELISA tradicional. Primeiro, ECL no kit de ensaio é utilizado em vez de detecção colorimétrica. Em ECL, um sinal eléctrico estimula a produção local de propriedade medida (de luz), desacoplando assim o evento estimulação do sinal, o que reduz o fundo 14. Isto permite uma elevada sensibilidade, como pode ser visto na <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01HL105826 e K02HL114749 (Dr. Sadayappan) e American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) e 13POST14720024 (Dr. Govindan). Os autores agradecem o apoio de Dr. Jimmy Page, Jill Clampit e Dr. John Hudson, MSD, pelo excelente suporte técnico e literatura no desenvolvimento do ensaio.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
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