Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico
Summary
Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.
Abstract
Biomarcatori stanno diventando sempre più importante nel processo decisionale clinico, così come la scienza di base. Diagnosi di infarto del miocardio (MI) è in gran parte determinata rilevando proteine cardiaco-specifici nel siero o nel plasma dei pazienti come indicatore di danno miocardico. Avendo recentemente dimostrato che miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C) è rilevabile nel siero dopo MI, abbiamo proposto come potenziale biomarker per MI. Biomarcatori sono in genere rilevati dai tradizionali panino saggi immunoenzimatica. Tuttavia, questa tecnica richiede un volume di campione grande, ha una piccola gamma dinamica, e può misurare solo una proteina alla volta.
Qui vi mostriamo un test immunologico multiplex in cui tre proteine cardiache possono essere misurate simultaneamente con alta sensibilità. Misurare cMyBP-C in Uniplex o insieme a creatina chinasi MB e troponina cardiaca ho mostrato sensibilità paragonabile. Questa tecnica utilizza il Meso Scale Discovery(MSD) metodo di multiplazione in una piastra a 96 pozzetti combinato con ElettroChemiLuminescenza per il rilevamento. Mentre sono necessari solo piccoli volumi di campione, alta sensibilità e una grande gamma dinamica si ottengono. Utilizzando questa tecnica, abbiamo misurato cMyBP-C, creatina chinasi MB e troponina cardiaca I livelli in campioni di siero di 16 soggetti con infarto miocardico e confrontato i risultati con 16 soggetti di controllo. Siamo stati in grado di rilevare tutti i tre marcatori in questi campioni e ho trovato tutti e tre i biomarcatori per essere aumentati dopo il MI. Questa tecnica è quindi adatto per la rivelazione sensibile dei marcatori cardiaci in campioni di siero.
Introduction
La misura di basse quantità di proteine in campioni biologici complessi, quali siero, è di crescente importanza clinica per la gestione del paziente, così come la scienza di base. Per esempio, un aumento dei livelli sierici di marcatori cardiaci, quali troponina I, in un ambiente clinico è coerente con infarto acuto del miocardio (MI) 1. Per rilevare le proteine in campioni di siero, saggio immunoenzimatico standard (ELISA) è la tecnica più utilizzata come ha alta sensibilità e consente la quantificazione assoluta dell'analita. Tuttavia, ELISA tradizionali richiedono una quantità relativamente grande di campione (tipicamente 100 pl), hanno alta segnale di fondo in alcuni fluidi biologici, e sono limitati alla misurazione di un solo analita per ELISA 2.
Recentemente, una nuova tecnica di immunodosaggio è stata introdotta che aggira molti di questi inconvenienti. Questo test modificato, sviluppato da MSD, utilizza electrochemiluminescrenza (ECL) per la rilevazione del segnale, che consente un background molto bassa e una maggiore sensibilità, consentendo l'uso di piccoli volumi di campione. ElettroChemiLuminescenza è basato sulla molecola reporter rutenio (II) trisbipyridal, che è attaccato agli anticorpi di rivelazione. Questa molecola reporter emette luce a 620 nm sulla stimolazione elettrica del fondo della piastra a 96 pozzetti dotato di elettrodi di carbonio in essi integrati 3. Inoltre, utilizzando rivestimento macchia, anticorpi di cattura multipli possono essere rivestiti in un pozzetto (fino a 10 su una piastra a 96 pozzetti), consentendo la quantificazione simultanea di proteine differenti in un singolo campione 4. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per misurare profili di citochine proinfiammatorie nel siero 5,6. Le piastre multiplex da MSD reggono bene il confronto con altre piattaforme di test multiplex 7.
Utilizzando MSD come la piattaforma di riferimento primario, abbiamo ulteriormente sviluppato un custom made piatto 3-plex che cdi quantificare simultaneamente il livello di miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C), creatina-chinasi MB (CK-MB) e troponina I cardiaca (cTnI), ed i risultati sono stati confrontati con il rilevamento monoplex di cMyBP-C. CK-MB e cTnI sono biomarcatori ben consolidate per MI. Tuttavia, gli aumenti di questi marcatori possono essere causati da patologie diverse da MI, es miocardite o insufficienza renale 8. Questo sostiene l'aggiunta di biomarcatori supplementari per aumentare la specificità della diagnosi di MI. Abbiamo recentemente dimostrato che cMyBP-C è anche un potenziale biomarcatore per MI 9. cMyBP-C è un filamento spesso associata proteina che è espressa nel cuore, 10-12 ma non nei muscoli scheletrici o lisci. Così, l'aumento del livello di cMyBP-C nel sistema circolatorio è un indicatore specifico di danno cardiaco 13.
In questo studio, abbiamo confrontato rilevamento uniplex di cMyBP-C con l'uso di un saggio 3-plex personalizzato per misurare i livelli sierici dicMyBP-C, CK-MB e cTnI nel siero dei pazienti con infarto miocardico. In futuro, questa tecnica di firma può essere utilizzato per diagnosticare MI in pazienti che si presentano con dolore toracico in Pronto Soccorso.
La board review istituzione (IRB) del Loyola University di Chicago ha approvato lo studio per l'utilizzo di campioni umani deidentified e l'uso del saggio immunologico (LU # 20392).
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, mostriamo l'applicabilità di un immunodosaggio multiplex per la rilevazione di più marcatori cardiaci nel siero di pazienti. Questa tecnica presenta numerosi vantaggi rispetto tradizionale ELISA. Prima, nel kit ECL saggio è usato invece di rilevazione colorimetrica. In ECL, un segnale elettrico stimola la produzione locale di proprietà misurate (luce), quindi sganciare l'evento stimolazione dal segnale, che riduce sfondo 14. Questo permette di elevata sensibilità, come si può v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R01HL105826 e K02HL114749 (Dr. Sadayappan), e American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) e 13POST14720024 (Dr. Govindan). Gli autori ringraziano l'assistenza del dottor Jimmy Page, Jill Clampit e Dr. John Hudson, MSD, per la loro eccellente supporto tecnico e la letteratura nello sviluppo del test.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
