電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法
Summary
複雑な生体試料中のバイオマーカーの測定はますます意思決定臨床指導されています。私たちは、同時に心臓ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋梗塞と健常者の被験者からの血清サンプル中の心筋トロポニンIを測定する高感度な方法を説明します。
Abstract
バイオマーカーだけでなく、基礎科学、意思決定の臨床でますます重要になってきています。診断心筋梗塞（MI）は、主に心筋障害の指標として患者の血清または血漿中の心臓特異的タンパク質を検出することによって駆動される。心臓ミオシン結合タンパク質-C（cMyBP-C）はMI後に血清中で検出可能であることが最近示されたので、我々は、MIの可能性バイオマーカーとして提案している。バイオマーカーは、典型的には、従来のサンドイッチ酵素免疫アッセイによって検出される。しかし、この技術は、大規模なサンプル量を必要とする小さいダイナミックレンジを有しており、同時に複数のタンパク質を測定することができる。
ここでは、3つの心臓タンパク質を高感度で同時に測定することができる多重イムノアッセイを示す。クレアチンキナーゼMBや心筋トロポニンとともにuniplexでcMyBP-Cを測定するか、または私が同等の感度を示した。この手法は、メソスケールディスカバリーを使用しています検出のための電気化学発光と組み合わせる96ウェルプレートに多重化（MSD）メソッド。わずかなサンプル量が必要とされているが、高感度、広いダイナミックレンジが得られる。このテクニックを使用して、我々はcMyBP-C、クレアチンキナーゼMB、および心筋トロポニンMIと16科目からの血清サンプル中の私はレベルを測定し、16対照被験者と比較を行った。我々は、これらのサンプルのすべての3つのマーカーを検出することができたとMI後に増加するすべての3つのバイオマーカーを発見した。この技術は、したがって、血清サンプル中の心臓マーカーの高感度検出に適している。
Introduction
血清などの複雑な生物学的サンプル中のタンパク質の少量の測定は、患者管理のための成長臨床的重要性、並びに基礎科学である。例えば、このようなトロポニンなどの心臓マーカーの血清レベルの増加は、私は、臨床で急性心筋梗塞（MI）1と一致する。それは、高感度を有しており、検体の絶対的定量を可能にするような血清試料中のタンパク質を検出するために、標準的な酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）は、最も頻繁に使用される技術である。しかしながら、従来のELISA法では、試料の比較的多量（典型的には100μl）を必要とするいくつかの生物学的液体中の高バックグラウンド信号を有し、ELISA 2ごとに1つだけの検体の測定に制限される。
最近では、新しい免疫測定技術は、これらの欠点の多くを回避することを導入されました。この修正されたアッセイは、MSDが開発した、electrochemiluminescを使用しています少量のサンプル量の使用を可能にする、非常に低いバックグラウンドおよび感度の向上を可能にする信号検出用リファレンス（ECL）。電気化学発光を検出抗体に添付されたレポーター分子ルテニウム（II）trisbipyridal、に基づいています。このレポーター分子は、それら3に一体化炭素電極を有する96ウェルプレートの底部の電気的な刺激により620nmで発光する。また、スポットコーティングを使用することによって、複数の捕捉抗体は、単一の試料4中の異なるタンパク質の同時定量を可能にする、1つのウェル（96ウェルプレート上で10まで）に塗布することができる。この技術は、近年、血清5,6の炎症性サイトカインプロファイルを測定するために使用されている。 MSDから多重プレートは他のマルチプレックスアッセイプラットフォームに好意的に7を比較します。
主要なアッセイプラットフォームとしてMSD使用して、我々はさらに3プレックスプレートCそのカスタムメイドを開発同時に心臓ミオシン結合タンパク質-C（cMyBP-C）、クレアチンキナーゼMB（CK-MB）、および心臓トロポニンI（cTnIの）のレベルを定量化し、その結果をcMyBP-Cのモノプレックス検出と比較した。 CK-MBとcTnIのはMIのための十分に確立されたバイオマーカーである。しかし、これらのバイオマーカーの増加はMI、 例えば心筋炎または腎不全8以外の病態が原因で発生することができます。これは、MI診断の特異性を増大させる付加的なバイオマーカーの付加のために主張している。我々は、最近cMyBP-Cはまた、MI 9の潜在的なバイオマーカーであることが示されている。 cMyBP-Cは心臓、10-12でなく、骨格または平滑筋に発現しているタンパク質を関連付け太いフィラメントです。このように、循環系におけるcMyBP-Cの増加レベルは、心臓障害13の具体的な指標である。
本研究では、血清レベルのを測定するためのカスタム3プレックスアッセイの使用とcMyBP-Cのuniplex検出を比較したMI患者の血清中cMyBP-C、CK-MB、およびcTnIの。将来的には、この署名技術は、緊急治療室での胸痛を呈する患者で心筋梗塞を診断するために使用されるかもしれません。
ロヨラ大学シカゴの機関審査委員会（IRB）はdeidentifiedヒトサンプルの使用とイムノアッセイの使用（LU＃20392）のための研究を承認した。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、患者からの血清中の複数の心臓のバイオマーカーの検出のためのマルチプレックスイムノアッセイの適用可能性を示しています。この技術は、伝統的なELISA比べて数多くの利点を有する。まず、アッセイキットでECLを比色検出の代わりに使用されている。 ECLにおいて、電気信号は、このような背景14を減少させる信号から刺激イベントを切り離す、測定された特性（光）…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
11PRE7240022（氏Barefield）と13POST14720024（博士ゴヴィンダン）、本研究では、健康補助R01HL105826とK02HL114749（博士Sadayappan）とアメリカ心臓協会中西部フェローシップの国立研究所によって資金を供給された。作者は感謝してアッセイを開発する上で、その優れた技術とサポートのための文学博士のジミー·ペイジ、ジルClampitとドクタージョンハドソン、MSD、の支援を認める。
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
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