Electrochemiluminescence आमापन द्वारा सीरम कार्डिएक मायोसिन बाइंडिंग प्रोटीन सी के निर्धारण के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट Quantitation विधि
Summary
जटिल जैविक नमूनों में मापने बायोमार्कर तेजी से निर्णय लेने नैदानिक मार्गदर्शक है. हम एक साथ हृदय मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी, creatine kinase एमबी, और रोधगलन और स्वस्थ नियंत्रण विषयों के साथ विषयों से सीरम नमूनों में हृदय troponin मैं मापने के लिए एक बेहद संवेदनशील विधि का वर्णन है.
Abstract
बायोमार्कर के साथ ही बुनियादी विज्ञान, निर्णय लेने नैदानिक में तेजी से और अधिक महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं. निदान रोधगलन (एमआई) काफी हद तक दौरे चोट का एक संकेतक के रूप में मरीजों के सीरम या प्लाज्मा में हृदय विशेष प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा संचालित है. हाल ही में हृदय मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी (cMyBP सी) एमआई के बाद सीरम में detectable है कि दिखाया गया है, तो हम एमआई के लिए एक संभावित biomarker के रूप में यह प्रस्ताव किया है. बायोमार्कर आम तौर पर पारंपरिक सैंडविच एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays के द्वारा पता चला रहे हैं. हालांकि, इस तकनीक का एक बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है एक छोटे गतिशील रेंज है, और एक समय में केवल एक प्रोटीन उपाय कर सकते हैं.
यहाँ हम तीन हृदय प्रोटीन उच्च संवेदनशीलता के साथ एक साथ मापा जा सकता है, जिसमें एक मल्टीप्लेक्स immunoassay दिखा. Creatine kinase MB और हृदय troponin साथ uniplex में या एक साथ cMyBP सी मापने मैं तुलनीय संवेदनशीलता दिखाई. इस तकनीक को मेसो स्केल डिस्कवरी का उपयोग करता हैपता लगाने के लिए electrochemiluminescence के साथ संयुक्त 96 अच्छी तरह से थाली में बहुसंकेतन की (एमएसडी) विधि. केवल छोटा सा नमूना संस्करणों की आवश्यकता होती है, वहीं उच्च संवेदनशीलता और एक बड़ी गतिशील रेंज हासिल कर रहे हैं. इस तकनीक का उपयोग करना, हम cMyBP सी, creatine kinase एमबी, और हृदय troponin एमआई के साथ 16 विषयों से सीरम नमूनों में मैं स्तर को मापा और 16 नियंत्रण विषयों के साथ परिणाम की तुलना में. हम इन नमूनों में सभी तीन मार्करों पता लगाने में सक्षम थे और एमआई के बाद बढ़ाया जा करने के लिए सभी तीन बायोमार्कर पाया. इस तकनीक, इसलिए, सीरम नमूनों में हृदय बायोमार्कर के संवेदनशील पता लगाने के लिए उपयुक्त है.
Introduction
इस तरह के सीरम के रूप में जटिल जैविक नमूने, में प्रोटीन की कम मात्रा का माप रोगी प्रबंधन, साथ ही बुनियादी विज्ञान के लिए बढ़ती नैदानिक महत्व का है. उदाहरण के लिए, एक नैदानिक सेटिंग में ऐसे ट्रोपोनिन मैं के रूप में कार्डियक बायोमार्कर के सीरम का स्तर,, में वृद्धि की तीव्र रोधगलन (एमआई) 1 के अनुरूप है. यह उच्च संवेदनशीलता है और analyte की पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है के रूप में सीरम नमूनों में प्रोटीन का पता लगाने के लिए, मानक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) सबसे अक्सर इस्तेमाल तकनीक है. हालांकि, पारंपरिक ELISAs, नमूना के एक अपेक्षाकृत बड़ी राशि (आमतौर पर 100 μl) की आवश्यकता होती है कुछ जैविक तरल पदार्थ में उच्च पृष्ठभूमि संकेत है, और एलिसा 2 प्रति केवल एक analyte की माप के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं.
हाल ही में, एक नए immunoassay तकनीक इन कमियों के कई circumvents कि पेश किया गया था. इस संशोधित परख, एमएसडी द्वारा विकसित, electrochemiluminesc का उपयोग करता हैछोटा सा नमूना संस्करणों के उपयोग को सक्षम करने, एक बहुत कम पृष्ठभूमि और एक वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए अनुमति देता है जो संकेत का पता लगाने के लिए खिलाडि़यों (ईसीएल). Electrochemiluminescence पता लगाने के एंटीबॉडी से जुड़ी है जो पत्रकार अणु दयाता (द्वितीय) trisbipyridal, पर आधारित है. इस संवाददाता अणु उन्हें 3 में एकीकृत कार्बन इलेक्ट्रोड है जो 96 अच्छी तरह से थाली के नीचे की बिजली की उत्तेजना पर 620 एनएम पर प्रकाश का उत्सर्जन करता है. इसके अलावा, हाजिर कोटिंग का उपयोग करके, एकाधिक कब्जा एंटीबॉडी एक भी नमूना 4 में विभिन्न प्रोटीन के एक साथ मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, अच्छी तरह से एक (10 करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली पर) में लेपित किया जा सकता है. इस तकनीक को हाल ही में सीरम 5,6 में proinflammatory साइटोकाइन प्रोफाइल को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एमएसडी से मल्टीप्लेक्स प्लेटें कृपापूर्वक अन्य मल्टीप्लेक्स परख प्लेटफार्मों पर 7 की तुलना करें.
प्राथमिक परख मंच के रूप में एमएसडी का उपयोग करना, हम आगे 3 परिसर थाली बना एक कस्टम विकसित की है कि गएक एक साथ हृदय मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी (cMyBP सी), क्रिएटिन-काइनेज एमबी (सी.के. MB), और हृदय troponin मैं (cTnI) के स्तर यों, और परिणाम cMyBP सी के monoplex पता लगाने के साथ तुलना की गई. सी.के. MB और cTnI एमआई के लिए अच्छी तरह से स्थापित बायोमार्कर हैं. हालांकि, इन बायोमार्कर की बढ़ जाती है जैसे मायोकार्डिटिस या गुर्दे की विफलता 8, एमआई के अलावा अन्य विकृतियों के कारण हो सकता है. यह एमआई निदान की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त बायोमार्कर के अलावा के लिए तर्क है. हमने हाल ही में cMyBP सी भी एमआई 9 के लिए एक संभावित biomarker है कि पता चला है. cMyBP सी दिल, लेकिन नहीं कंकाल या चिकनी मांसपेशियों में 10-12 में व्यक्त किया है कि एक मोटी रेशा जुड़े प्रोटीन है. इस प्रकार, संचार प्रणाली में cMyBP सी की वृद्धि हुई स्तर हृदय की क्षति 13 साल की एक विशिष्ट सूचक है.
इस अध्ययन में, हम सीरम का स्तर मापने के लिए एक कस्टम 3 plex परख के उपयोग के साथ cMyBP सी के uniplex पता लगाने की तुलनाcMyBP सी, सी.के. MB, और एमआई के साथ रोगियों के सीरम में cTnI. भविष्य में, इस हस्ताक्षर तकनीक आपातकालीन कक्ष में सीने में दर्द के साथ पेश रोगियों में एमआई का निदान किया जा सकता है.
लोयोला विश्वविद्यालय शिकागो की संस्था समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) deidentified मानव नमूनों के उपयोग और immunoassay का उपयोग (लू # 20392) के लिए अध्ययन को मंजूरी दे दी.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this study, we show the applicability of a multiplex immunoassay for the detection of multiple cardiac biomarkers in serum from patients. This technique has numerous advantages over traditional ELISA. First, ECL in the assay kit is used instead of colorimetric detection. In ECL, an electrical signal stimulates the local production of the measured property (light), thus uncoupling the stimulation event from the signal, which reduces background14. This allows for high sensitivity, as can be seen in Ta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by National Institutes of Health grants R01HL105826 and K02HL114749 (Dr. Sadayappan), and American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) and 13POST14720024 (Dr. Govindan). The authors gratefully acknowledge the assistance of Dr. Jimmy Page, Jill Clampit and Dr. John Hudson, MSD, for their excellent technical and literature support in developing the assay.
Materials
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
