L'isolement, la culture, et la transplantation de cellules satellites du muscle
Summary
L'isolement et la culture d'une population pure de cellules satellites quiescentes, une population de cellules souches musculaires, est essentielle à la compréhension de muscle tige de la biologie cellulaire et la régénération, ainsi que la transplantation de cellules souches pour des thérapies dans la dystrophie musculaire et d'autres maladies dégénératives.
Abstract
Cellules musculaires satellites sont une population de cellules souches requis pour le développement du muscle squelettique et de la régénération post-natal, ce qui représente 2 à 5% des noyaux sublaminal dans les fibres musculaires. Dans le muscle adulte, les cellules satellites sont normalement mitotique repos. Après une lésion, cependant, les cellules satellites initier la prolifération cellulaire pour produire des myoblastes, leurs descendants, de médiation de la régénération du muscle. La transplantation de myoblastes dérivés des cellules satellites a été largement étudiée comme traitement possible pour plusieurs maladies régénératrices y compris la dystrophie musculaire, l'insuffisance cardiaque et de dysfonction urologique. Transplantation de myoblastes dans le muscle dystrophique squelettique, cardiaque infarctus, et dysfonctionnement des canaux urinaires a montré que les myoblastes greffés peuvent se différencier en fibres musculaires dans les tissus de l'hôte et afficher une amélioration fonctionnelle partielle dans ces maladies. Par conséquent, le développement de procédés de purification efficace de cellules satellites quiescentes de MUSCL squelettiquee, ainsi que la mise en place de satellites cultures de myoblastes dérivés des cellules et des méthodes de transplantation de myoblastes pour, sont essentielles pour comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine satellite cellule auto-renouvellement, l'activation et la différenciation. En outre, le développement de thérapies à base de cellules pour la dystrophie musculaire et d'autres maladies de régénération sont également tributaires de ces facteurs.
Cependant, les procédés de purification éventuels courants de cellules satellites quiescentes nécessitent l'utilisation de coûteux tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de la machine. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la purification rapide, économique et fiable des cellules satellites de repos de la souris adulte muscle squelettique par dissociation enzymatique suivie par cellule magnétique-trieur (MACS). Après isolement des cellules satellites quiescentes pures, ces cellules peuvent être cultivées afin d'obtenir un grand nombre de myoblastes après plusieurs passages. Ces fraîchement isolécellules satellites quiescentes ou ex vivo des myoblastes élargis peuvent être transplantées dans cardiotoxine (CTX) induite par la régénération du muscle squelettique de souris pour examiner la contribution des cellules dérivées du donneur à la régénération des fibres musculaires, ainsi que de compartiments cellulaires par satellite pour l'examen de l'auto-renouvellement activités.
Introduction
Cellules musculaires satellites sont une petite population de cellules souches myogéniques situés sous la lame basale des fibres musculaires squelettiques. Ils sont caractérisés par l'expression de Pax7, Pax3, c-Met, M-cadhérine, CD34, Syndecan-3, et la calcitonine de 1 – 3. Les cellules satellites sont révélés être responsable de la régénération du muscle en tant que cellules souches musculaires. Dans le muscle adulte, les cellules satellites sont normalement mitotique repos 4-8. Après une lésion, les cellules satellites sont activées, lancer expression de MyoD, et entrer dans le cycle cellulaire pour élargir leur progéniture, appelé cellules précurseurs myogéniques ou myoblastes 3. Après plusieurs cycles de division cellulaire, les myoblastes sortent du cycle cellulaire et fusible à l'autre, afin de subir une différenciation en myotubes multi-nucléées, suivis par les fibres musculaires matures. Myoblastes isolés à partir de tissus musculaires adultes peuvent facilement être étendues ex vivo. La capacité de myoblastes pour devenir les fibres musculaires dans la régénération musculaire et àforme extra-utérines fibres musculaires dans les tissus non musculaires est exploitée par la transplantation de myoblastes, une approche thérapeutique potentielle pour la myopathie de Duchenne (DMD) 4, le dysfonctionnement urologique 9, et l'insuffisance cardiaque 10. En effet, les myoblastes ont été transplantés avec succès dans le muscle des deux mdx (modèle DMD) des souris et des patients atteints de DMD 11-14. Les myoblastes normaux injectés fusionnent avec les fibres musculaires de l'hôte pour améliorer l'histologie et la fonction du muscle malade. Des travaux antérieurs ont démontré que des sous-populations de myoblastes sont plus cellule souche analogue et restent dans un état indifférencié plus dans le muscle pendant la régénération du muscle 5. Des travaux récents ont montré que les cellules satellites du muscle fraîchement isolés adulte contiennent une population de cellules souches ressemblant que présente la prise de greffe plus efficace et l'activité d'auto-renouvellement dans la régénération musculaire 5-8. Par conséquent, la purification d'une population pure de cellules satellites quiescentes de mu squelettique adultesclérose est essentielle pour la compréhension de la biologie des cellules satellites, les myoblastes et la régénération musculaire, et pour le développement de thérapies à base de cellules.
Cependant, les procédés de purification éventuels courants de cellules satellites quiescentes nécessitent l'utilisation d'un tri cellulaire activé par fluorescence chère (FACS) Machine 1,2,6-8. En outre, l'exposition au laser FACS a tendance à induire la mort cellulaire au cours de la séparation, ce qui entraîne un rendement plus faible des cellules satellites quiescentes 15. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la purification rapide, économique et fiable des cellules satellites de repos du muscle squelettique de souris adulte. Cette méthode utilise la dissociation enzymatique suivie par cellule magnétique-trieur (MACS). Après isolement des cellules satellites quiescentes pures, ces cellules peuvent être cultivées afin d'obtenir un grand nombre de myoblastes après plusieurs passages. Nous montrons également que l'injection intramusculaire de ces cellules satellites quiescentes fraîchement isolés ou ex vimyoblastes vo étendues peuvent être transplantées dans cardiotoxine (CTX) induit la régénération du muscle squelettique de souris pour examiner la contribution des cellules dérivées du donneur à la régénération des fibres musculaires, ainsi que des compartiments cellulaires par satellite pour l'examen des activités d'auto-renouvellement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, les cellules satellites quiescentes peuvent être facilement purifiés à partir de muscle squelettique de souris adultes, par digestion à la collagénase et de séparation MACS médiée par des anticorps de surface. Cette méthode prend environ 6 heures et ne nécessite pas d'équipement coûteux tel qu'une machine FACS. En outre, ce procédé est relativement peu coûteux par rapport à la surface médiée par les anticorps séparation FACS. On obtient un rendement plus élevé de cellules …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Shahragim Tajbakhsh pour fournir souris Myf5 + / nlacZ. Nous remercions également Alexander Hron et Michael Baumrucker pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Muscular Dystrophy Association (MDA) et Gregory Marzolf Jr. MD Centre Award.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
References
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
