בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר
Summary
הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.
Abstract
תאי לווין בשרירים הם אוכלוסייה של תאי גזע הנדרשת לפיתוח שרירי שלד לאחר לידה והתחדשות, והיוו 2-5% מגרעיני sublaminal בסיבי שריר. בשריר בוגר, תאי לווין הם בדרך כלל mitotically שקטים. בעקבות פציעה, לעומת זאת, תאי לווין ליזום התרבות תאים לייצר myoblasts, progenies, לתווך ההתחדשות של שריר. השתלה של myoblasts תאים שמקורם בלווין נחקרה באופן נרחב כטיפול אפשרי למחל משובי כוללים ניוון שרירים, אי ספיקת לב, ובעיות בתפקוד אורולוגים. השתלת myoblast לתוך שריר dystrophic שלד, לב infarcted, וצינוריות שתן dysfunctioning הוכיחה כי myoblasts engrafted יכולה להתמיין לסיבי שריר ברקמות המארח ולהציג שיפור תפקודי חלקי במחלות אלה. לכן, הפיתוח של שיטות טיהור יעילה של תאי לווין רדומים מmuscl השלדדואר, כמו גם את הקמתה של תרבויות בלווין שמקורן בתאים והיצמדות למנגנון ושיטות השתלה לmyoblasts, הם חיוניים להבנת המנגנונים המולקולריים מאחורי התחדשות העצמית של תאי לווין, הפעלה, והבחנה. בנוסף, פיתוח הטיפולים מבוססי תאים לניוון שרירים ומחלות אחרות משובי תלויים גם בגורמים אלה.
עם זאת, שיטות טיהור פוטנציאלי הנוכחיות של תאי לווין שקטים דורשות שימוש במיון הקרינה המופעל יקר תא מכונות (FACS). כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לטיהור המהירה, חסכונית, ואמינה של תאי לווין רדומים משרירי שלד עכבר מבוגרים ידי ניתוק האנזימטית ואחריו תא הופעל מגנטי מיון (MACS). בעקבות בידוד של תאי לווין שקטים טהורים, יכולים להיות מתורבת תאים אלה כדי להשיג מספר גדול של myoblasts אחרי כמה קטעים. טרי מבודד אלהתאי לווין רדומים או myoblasts לשעבר הרחיבה vivo ניתן להשתיל לתוך cardiotoxin (CTX) המושרה התחדשות שריר שלד עכבר כדי לבחון את התרומה של תאים שמקורם בתורם להתחדשות סיבי שריר, כמו גם לתאי תאי לווין לבחינת עצמית והתחדשות פעילויות.
Introduction
תאי לווין בשרירים הם אוכלוסייה קטנה של תאי גזע myogenic ממוקמים מתחת lamina הבסיס של סיבי שריר שלד. הם מאופיינים על ידי הביטוי של Pax7, PAX3, c-Met, M-cadherin, CD34, Syndecan-3, וקלציטונין 3 – 1. תאי לווין הוכיחו להיות אחראי להתחדשות שרירים כמו שריר בתאי גזע. בשריר בוגר, תאי לווין הם בדרך כלל mitotically שקטים 4-8. בעקבות פציעה, תאי לווין מופעלים, ליזום ביטוי של MyoD, והזן את מחזור התא להרחבת צאצאיהם, המכונה תאים מבשר myogenic או myoblasts 3. לאחר כמה סיבובים של חלוקת תא, myoblasts לצאת ממחזור התא ונתיך אחד לשני כדי לעבור התמיינות לmyotubes רב גרעיני, ואחריו סיבי שריר בוגר. בקלות ניתן להרחיב Myoblasts מבודד משרירי מבוגרים vivo לשעבר. יכולת myoblasts להפוך לסיבי שריר בהתחדשות שריר ולצורת סיבי שריר מחוץ לרחם ברקמות nonmuscle מנוצלים על ידי השתלת היצמדות למנגנון, גישה טיפולית פוטנציאלית בניוון שרירים דושן (DMD) 4, חוסר תפקוד אורולוגית 9, ואי ספיקת לב 10. ואכן, myoblasts הושתלה בהצלחה בשרירים של שני עכברי MDX (מודל DMD) וחולי DMD 11-14. Myoblasts הנורמלית הזריקו הפתיל עם סיבי שריר מארח כדי לשפר את ההיסטולוגיה ותפקוד של השריר הפגוע. עבודות קודמות הראו כי אוכלוסיות של myoblasts הם יותר גזע דמוי תא ולהישאר במצב מובחן יותר בשריר במהלך התחדשות שרירים 5. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי לווין מבודדים טרי משרירים בוגרים להכיל אוכלוסייה כמו תא גזע שמפגינה engraftment יעיל יותר ופעילות התחדשות עצמית בהתחדשות השריר 5-8. לכן, טיהור של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין רדומים מmu שלד המבוגרscle הוא חיוני להבנת הביולוגיה של תאי לווין, myoblasts והתחדשות שרירים, ולפיתוח טיפולים מבוססי תאים.
עם זאת, שיטות טיהור פוטנציאלי הנוכחיות של תאי לווין שקטים דורשות שימוש במיון הקרינה המופעל תא מכונה יקר (FACS) 1,2,6-8. בנוסף, חשיפת לייזר FACS נוטה לגרום למוות של תאים בהפרדה, מה שגורם לתשואה נמוכה של תאי לווין שקטים 15. כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לטיהור המהירה, חסכונית, ואמינה של תאי לווין רדומים משרירי שלד עכבר מבוגר. בשיטה זו משתמשת דיסוציאציה האנזימטית ואחריו תא הופעל מגנטי מיון (MACS). בעקבות בידוד של תאי לווין שקטים טהורים, יכולים להיות מתורבת תאים אלה כדי להשיג מספר גדול של myoblasts אחרי כמה קטעים. כמו כן, אנו מראים כי זריקה תוך שרירית של תאים אלה מבודדים טריים שקטים לווין או לשעבר viניתן להשתיל myoblasts vo התרחבה לcardiotoxin (CTX) המושרה התחדשות שריר שלד עכבר כדי לבחון את התרומה של תאים שמקורם בתורם להתחדשות סיבי שריר, כמו גם לתאי תאי לווין לבחינת פעילות התחדשות עצמית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, יכול להיות מטוהר תאי לווין רדומים בקלות משרירי שלד מבוגרים של עכברים על ידי עיכול collagenase והפרדת MACS בתיווך נוגדני פני השטח. שיטה זו לוקחת בערך 6 שעות ולא צריכה שום ציוד יקר כגון מכונה FACS. בנוסף, שיטה זו היא זולה יחסית בהשוואה להפרדת FACS בתיווך נוגדני פני השט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר Shahragim Tajbakhsh למתן עכברי Myf5 + / nLacZ. אנו מודים גם לאלכסנדר רון ומיכאל Baumrucker לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מניוון השרירים האגודה (מד"א) וגרגורי Marzolf ג'וניור MD מרכז פרס.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
References
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
