Изоляция, культура, и трансплантация мышечных сателлитных клеток
Summary
Выделение и культура чистой популяции покоящихся сателлитных клеток, мышц стволовых клеток населения, имеет важное значение для понимания мышечной биологии стволовых клеток и регенерации, а также трансплантации стволовых клеток для лечения в мышечной дистрофии и других дегенеративных заболеваний.
Abstract
Мышцы спутниковые клетки стволовых клеток населения необходимы для постнатального развития скелетных мышц и регенерации, что составляет 2-5% от sublaminal ядер в мышечных волокнах. Во взрослой мышцы, клетки-сателлиты, как правило, митотически покоя. После травмы, однако, сателлитные клетки инициировать пролиферацию клеток, чтобы произвести миобластов, их потомство, посреднические регенерацию мышц. Трансплантация клеток, полученных миобластов спутниковых был широко изучен в качестве возможного лечения в течение нескольких регенеративных заболеваний, включая мышечную дистрофию, сердечной недостаточности, и урологической дисфункции. Трансплантация миобластов в дистрофических скелетных мышцах, инфаркта сердца, и неблагополучных мочевыводящих протоков показал, что привитые миобласты могут дифференцироваться в мышечные волокна в ткани хозяина и отображения частичное функциональное улучшение в этих заболеваний. Таким образом, разработка эффективных способов очистки покоящихся сателлитных клеток из скелетной MUSCLэ, а также созданию клеточных полученных культур миобластов спутниковых и методов трансплантации для миобластов, имеют важное значение для понимания молекулярных механизмов позади спутниковым клеток к самообновлению, активации и дифференциации. Кроме того, развитие клеточной терапии для мышечной дистрофии и других заболеваний регенеративных также зависит от этих факторов.
Однако современные перспективные методы очистки покоящихся сателлитных клеток требуют использования дорогостоящего флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS машин). Здесь мы представляем новый метод для быстрого, экономичного и надежного очистки покоящихся сателлитных клеток из взрослых мыши скелетных мышцах по ферментативной диссоциации с последующим магнитного активированный сортировки клеток (ПДК). После выделения чистых покоящихся сателлитных клеток, эти клетки могут быть культивированы для получения большого количества миобластов после нескольких пассажей. Эти Свежевыделенныепокоящиеся клетки-сателлиты или Экс Vivo расширенные миобласты можно пересадить в cardiotoxin (CTX), вызванной регенерации мыши скелетных мышц изучить вклад донора клеток в регенерации мышечных волокон, а также спутниковое клеток отделениями для рассмотрения самообновления деятельность.
Introduction
Мышцы спутниковые клетки небольшая популяция миогенных стволовых клеток, расположенных под базальной пластинки скелетных мышечных волокон. Они характеризуются выражением Pax7, Pax3, с-Met, М-кадгерина, CD34, синдекана-3, и кальцитонин 1 – 3. Спутниковые клетки оказались ответственны за регенерации мышц как мышечных стволовых клеток. Во взрослой мышцы, клетки-сателлиты, как правило, митотически покоя 4-8. После травмы, спутниковые клетки активируются, инициировать выражение MyoD и введите клеточный цикл, чтобы расширить свое потомство, называется миогенные клетки-предшественники или миобластов 3. После нескольких раундов деления клеток, миобластов выхода из цикла и предохранитель клеток друг с другом для того, чтобы пройти дифференцировку в мульти-дерных мышечных трубок, после чего зрелый мышечных волокон. Миобласты выделенные из взрослой мышцы легко может быть расширена экс естественных. Способность к миобластов стать мышечные волокна в регенерации мышц иформа внематочной мышечные волокна в немышечно тканей эксплуатируется трансплантации миобластов, потенциальный терапевтический подход для мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) 4, урологической дисфункции 9, и сердечной недостаточности 10. Действительно, миобласты успешно пересадили в мышцах обеих MDX (ДМД модель) мышей и пациентов с МДД 11-14. Инъецированные нормальные миобласты сливаться с хост мышечных волокон для улучшения гистологии и функции пораженного мышцы. Предыдущая работа показала, что субпопуляции миобластов более стволовых клеток, как и остаются в недифференцированном состоянии больше в мышцах во время регенерации мышечной 5. Последние исследования показали, что свежевыделенных спутниковые клетки из взрослых мышцы содержат клетки, как население штока, которая демонстрирует более эффективное приживление и самообновлению деятельность в регенерации мышц 5-8. Таким образом, очистка чистой популяции покоящихся сателлитных клеток из взрослых скелетных муSCLE имеет важное значение для понимания биологии сателлитных клеток, миобластов и регенерации мышц, и для развития клеточной терапии.
Однако современные перспективные методы очистки покоящихся сателлитных клеток требуют использования дорогостоящего флуоресцентно-активированном сортировки клеток (FACS) машины 1,2,6-8. Кроме того, FACS лазерное облучение имеет тенденцию вызывать гибель клеток в процессе разделения, которое вызывает низкий выход покоящихся клеток спутников 15. Здесь мы представляем новый метод быстрого, экономичного и надежного очистки покоящихся сателлитных клеток из взрослых мышей скелетных мышцах. Этот метод использует ферментативной диссоциации с последующим магнитного активированный сортировки клеток (ПДК). После выделения чистых покоящихся сателлитных клеток, эти клетки могут быть культивированы для получения большого количества миобластов после нескольких пассажей. Показано также, что внутримышечные инъекции этих свежевыделенных покоящихся сателлитных клеток или экс VIВ.О. расширенные миобласты можно пересадить в cardiotoxin (CTX), вызванной регенерации мыши скелетных мышц изучить вклад донора клеток к регенерации мышечных волокон, а также в отделениях спутниковых клеток для рассмотрения самообновления деятельности.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе покоя спутниковые клетки могут быть легко очищен от взрослых скелетных мышцах мышей по коллагеназой и поверхностных антитело-опосредованной разделения MACS. Этот метод принимает около 6 часов и не требует дорогостоящего оборудования, таких как машины FACS. Кроме того, это…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Shahragim Таджбахш для обеспечения мышей Myf5 + / nLacZ. Мы также благодарим Александра Грон и Майкл Baumrucker за критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана грантами от Ассоциации мышечной дистрофии (MDA) и Грегори Marzolf младший MD Center Award.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
References
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
