Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite
Summary
El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.
Abstract
Células satélite del músculo son una población de células madre necesaria para el desarrollo del músculo esquelético postnatal y la regeneración, que representan el 2-5% de núcleos sublaminal en las fibras musculares. En el músculo adulto, las células satélite son normalmente mitóticamente quiescentes. Después de una lesión, sin embargo, las células satélite inician la proliferación celular para producir mioblastos, sus progenies, para mediar en la regeneración del músculo. El trasplante de mioblastos derivados de células de satélite ha sido ampliamente estudiado como una posible terapia para varias enfermedades regenerativas, incluyendo la distrofia muscular, la insuficiencia cardíaca y la disfunción urológica. El trasplante de mioblastos en el músculo distrófico esquelético, corazón infartado, y el disfuncionamiento conductos urinarios ha demostrado que los mioblastos injertados pueden diferenciarse en las fibras musculares en los tejidos del huésped y mostrar mejoría funcional parcial en estas enfermedades. Por lo tanto, el desarrollo de métodos de purificación eficientes de las células satélite quiescentes de muscl esqueléticoelectrónico, así como el establecimiento de cultivos de mioblastos satélite derivados de células y métodos de trasplante de mioblastos, son esenciales para la comprensión de los mecanismos moleculares detrás de la auto-renovación de células satélite, activación y diferenciación. Además, el desarrollo de terapias basadas en células para la distrofia muscular y otras enfermedades regenerativas también son dependientes de estos factores.
Sin embargo, los métodos de purificación posibles actuales de las células satélite quiescentes requieren el uso de caros fluorescencia de clasificación de células activadas máquinas (FACS). A continuación, presentamos un nuevo método para la purificación rápida, económica y fiable de las células satélite en reposo de ratón músculo esquelético adulto por disociación enzimática seguida de células activadas por la clasificación magnética (MACS). Tras el aislamiento de las células satélite quiescentes puros, estas células pueden ser cultivadas para obtener un gran número de mioblastos después de varios pasajes. Estos recién aisladascélulas satélite quiescentes o ex vivo mioblastos expandidas pueden ser trasplantados en cardiotoxina (CTX) inducida por la regeneración de músculo esquelético de ratón para examinar la contribución de las células derivadas del donante a la regeneración de las fibras musculares, así como a los compartimentos de células satélite para el examen de auto-renovación actividades.
Introduction
Células satélite del músculo son una pequeña población de células madre miogénicas ubicados debajo de la lámina basal de las fibras musculares esqueléticas. Se caracterizan por la expresión de Pax7, Pax3, c-Met, M-cadherina, CD34, syndecan-3, y la calcitonina 1 – 3. Las células satélite han demostrado ser responsables de la regeneración muscular como células madre de músculo. En el músculo adulto, las células satélite son normalmente mitóticamente quiescentes 4-8. Después de la lesión, las células satélite se activan, iniciar la expresión de MyoD, y entrar en el ciclo celular para expandir su progenie, denominada células precursoras miogénicas o mioblastos 3. Después de varias rondas de división celular, mioblastos salir del ciclo celular y se fusionan entre sí con el fin de someterse a la diferenciación en miotubos multinucleadas, seguido por fibras musculares maduras. Los mioblastos aislados de músculo adulto fácilmente se pueden expandir ex vivo. La capacidad de los mioblastos para convertirse en fibras musculares en la regeneración muscular y paraforman fibras musculares ectópico en los tejidos no musculares es explotada por el trasplante de mioblastos, un enfoque terapéutico potencial para distrofia muscular de Duchenne (DMD) 4, disfunción urológica 9, y la insuficiencia cardiaca 10. De hecho, los mioblastos se han trasplantado con éxito en el músculo de mdx ambos (modelo DMD) ratones y pacientes con DMD 11-14. Los mioblastos normales inyectados se fusionan con las fibras musculares de acogida para mejorar la histología y la función del músculo enfermo. Trabajos anteriores demostraron que las subpoblaciones de mioblastos son más células madre similares, y permanecen en un estado indiferenciado ya en el músculo durante la regeneración muscular 5. Trabajos recientes han demostrado que las células satélite recién aisladas de músculo adulto contienen una población de células madre similares a las que presenta el injerto más eficiente y la actividad de auto-renovación en la regeneración muscular 5-8. Por lo tanto, la purificación de una población pura de células satélite quiescentes de MU esquelético adultoSCLE es esencial para la comprensión de la biología de las células satélite, mioblastos y la regeneración muscular, y para el desarrollo de terapias basadas en células.
Sin embargo, los métodos de purificación posibles actuales de las células satélite quiescentes requieren el uso de un activadas por fluorescencia caro clasificación de células (FACS) de la máquina 1,2,6-8. Además, la exposición al láser FACS tiende a inducir la muerte celular durante la separación, lo que provoca un menor rendimiento de las células satélite de reposo 15. A continuación, presentamos un nuevo método para la purificación rápida, económica y fiable de las células satélite en reposo desde el músculo esquelético de ratones adultos. Este método utiliza la disociación enzimática seguida por magnético de células activadas por la clasificación (MACS). Tras el aislamiento de las células satélite quiescentes puros, estas células pueden ser cultivadas para obtener un gran número de mioblastos después de varios pasajes. También ponen de manifiesto que la inyección intramuscular de estas células satélite quiescentes recién aisladas o ex vimioblastos vo expandidas pueden ser trasplantados en cardiotoxina (CTX) inducida por la regeneración del músculo esquelético del ratón para examinar la contribución de las células derivadas del donante de la regeneración de las fibras musculares, así como a los compartimentos celulares satelitales para el examen de las actividades de auto-renovación.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, las células satélite quiescentes se pueden purificar fácilmente a partir de músculo esquelético de los ratones adultos mediante digestión con colagenasa y la superficie mediada por anticuerpos separación MACS. Este método tarda aproximadamente 6 horas y no necesita ningún equipo costoso tal como una máquina de FACS. Además, este método es relativamente barato en comparación con la superficie mediada por anticuerpos FACS separación. Un mayor rendimiento de las células satélite de reposo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Shahragim Tajbakhsh para proporcionar ratones Myf5 + / nlacZ. También queremos agradecer a Alexander Hron y Michael Baumrucker para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de la Distrofia Muscular (MDA) y Gregory Marzolf Jr. Premio MD Center.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
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