स्नायु उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, और ट्रांसप्लांटेशन
Summary
मौन उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी के अलगाव और संस्कृति, एक मांसपेशी स्टेम सेल आबादी, मांसपेशियों में स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और उत्थान, साथ ही मांसपेशियों और अन्य अपक्षयी रोगों में उपचार के लिए स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण की समझ के लिए आवश्यक है.
Abstract
स्नायु उपग्रह कोशिकाओं मांसपेशी फाइबर में sublaminal नाभिक का 2-5% के लिए लेखांकन, प्रसव के बाद कंकाल की मांसपेशी विकास और उत्थान के लिए आवश्यक एक स्टेम सेल की आबादी हैं. वयस्क मांसपेशियों में उपग्रह कोशिकाओं सामान्य रूप से mitotically मौन हैं. चोट के बाद, हालांकि, उपग्रह कोशिकाओं की मांसपेशी के उत्थान के लिए मध्यस्थता करने के लिए myoblasts, उनके progenies, निर्माण करने के लिए सेलुलर प्रसार आरंभ. उपग्रह सेल व्युत्पन्न myoblasts का ट्रांसप्लांटेशन व्यापक रूप से पेशी dystrophy, दिल की विफलता, और मूत्र संबंधी रोग सहित कई पुनर्योजी रोगों के लिए एक संभव उपचार के रूप में अध्ययन किया गया है. Dystrophic कंकाल की मांसपेशी, infarcted दिल, और dysfunctioning मूत्र नलिकाओं में Myoblast प्रत्यारोपण engrafted myoblasts मेजबान ऊतकों में मांसपेशी फाइबर में अंतर है और इन बीमारियों में आंशिक कार्यात्मक सुधार प्रदर्शित कर सकते हैं कि दिखाया गया है. इसलिए, कंकाल muscl से मौन उपग्रह कोशिकाओं के कुशल शुद्धि के तरीकों का विकासई, के रूप में अच्छी तरह से उपग्रह सेल व्युत्पन्न myoblast संस्कृतियों और myoblasts के लिए प्रत्यारोपण के तरीकों की स्थापना के रूप में, उपग्रह सेल आत्म नवीकरण, सक्रियण, और भेदभाव के पीछे आणविक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक हैं. इसके अतिरिक्त, मांसपेशियों और अन्य पुनर्योजी रोगों के लिए सेल आधारित चिकित्सा का विकास भी इन कारकों पर निर्भर हैं.
हालांकि, मौन उपग्रह कोशिकाओं की मौजूदा भावी शुद्धि तरीकों महंगा प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) मशीनों के उपयोग की आवश्यकता. यहाँ, हम (एमएसीएस) छँटाई चुंबकीय सक्रिय सेल द्वारा पीछा एंजाइमी हदबंदी से वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशी से मौन उपग्रह कोशिकाओं का तेजी से किफायती और विश्वसनीय शुद्धि के लिए एक नया तरीका मौजूद है. शुद्ध मौन उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव के बाद इन कोशिकाओं को कई मार्ग के बाद myoblasts की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए संवर्धित किया जा सकता है. ये हौसले से अलगमौन उपग्रह कोशिकाओं या पूर्व vivo विस्तार myoblasts cardiotoxin में प्रत्यारोपित किया जा सकता है (CTX) मांसपेशी फाइबर regenerating के लिए दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के योगदान की जांच करने के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी regenerating प्रेरित है, साथ ही आत्म नवीकरण की परीक्षा के लिए उपग्रह सेल के डिब्बों को गतिविधियों.
Introduction
स्नायु उपग्रह कोशिकाओं कंकाल की मांसपेशी फाइबर के बेसल लामिना नीचे स्थित myogenic स्टेम कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी है. वे Pax7, Pax3, C-मिले, एम cadherin, CD34, Syndecan -3 की अभिव्यक्ति की विशेषता है, और कैल्सीटोनिन हैं 1 – 3. सैटेलाइट कोशिकाओं मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के रूप में पेशी के उत्थान के लिए जिम्मेदार साबित किया है. वयस्क मांसपेशियों में उपग्रह कोशिकाओं 4-8 सामान्य रूप से mitotically मौन हैं. चोट के बाद, उपग्रह कोशिकाओं MyoD की अभिव्यक्ति आरंभ, और उनकी संतान को बड़ा करने के लिए सेल चक्र में प्रवेश, सक्रिय कर रहे हैं, myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं या myoblasts 3 करार दिया. कोशिका विभाजन के कई दौर के बाद, myoblasts परिपक्व मांसपेशी फाइबर द्वारा पीछा बहु nucleated myotubes, में भेदभाव से गुजरना करने के क्रम में एक दूसरे के लिए सेल चक्र और फ्यूज बाहर निकलें. वयस्क मांसपेशियों से अलग myoblasts आसानी पूर्व vivo विस्तार किया जा सकता है. मांसपेशी regenerating में और मांसपेशी फाइबर बनने के लिए myoblasts के लिए क्षमताnonmuscle ऊतकों में फार्म अस्थानिक मांसपेशी फाइबर myoblast प्रत्यारोपण, Duchenne पेशी dystrophy (डीएमडी) 4 लिए एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण, मूत्र संबंधी शिथिलता 9, और दिल की विफलता के 10 से शोषण किया जाता है. दरअसल, myoblasts सफलतापूर्वक दोनों MDX (डीएमडी मॉडल) चूहों और DMD रोगियों 11-14 की मांसपेशी में प्रत्यारोपित किया गया है. इंजेक्शन सामान्य myoblasts रोगग्रस्त मांसपेशियों के ऊतक विज्ञान और समारोह में सुधार करने के लिए मेजबान मांसपेशी फाइबर के साथ फ्यूज. पिछला काम myoblasts की subpopulations अधिक सेल की तरह स्टेम और मांसपेशी पुनर्जनन 5 के दौरान मांसपेशियों में अब एक undifferentiated राज्य में रहते हैं जो प्रदर्शन किया. हाल ही में काम वयस्क मांसपेशियों से हौसले से अलग उपग्रह कोशिकाओं की मांसपेशी 5-8 regenerating में अधिक कुशल engraftment और आत्म नवीकरण गतिविधि दर्शाती है कि एक स्टेम सेल की तरह आबादी होते दिखाया गया है. इसलिए, वयस्क कंकाल म्यू से मौन उपग्रह कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी की शुद्धिscle उपग्रह कोशिकाओं, myoblasts और मांसपेशियों उत्थान के जीव विज्ञान को समझने के लिए, और सेल आधारित चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है.
हालांकि, मौन उपग्रह कोशिकाओं की मौजूदा भावी शुद्धि तरीकों एक महंगी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) मशीन 1,2,6-8 के उपयोग की आवश्यकता. इसके अलावा, FACS लेजर जोखिम मौन उपग्रह कोशिकाओं 15 की कम उपज के कारण होता है जो जुदाई के दौरान कोशिका मृत्यु को उत्पन्न करने के लिए जाता है. यहाँ, हम वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशी से मौन उपग्रह कोशिकाओं का तेजी से किफायती और विश्वसनीय शुद्धि के लिए एक नया तरीका मौजूद है. इस विधि (एमएसीएस) छँटाई चुंबकीय सक्रिय सेल द्वारा पीछा एंजाइमी हदबंदी का इस्तेमाल करता. शुद्ध मौन उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव के बाद इन कोशिकाओं को कई मार्ग के बाद myoblasts की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए संवर्धित किया जा सकता है. हम यह भी पता चलता है कि इन हौसले से अलग मौन उपग्रह कोशिकाओं या पूर्व छठी की इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शनVo विस्तार myoblasts cardiotoxin में प्रत्यारोपित किया जा सकता है (CTX) मांसपेशी फाइबर, साथ ही आत्म नवीकरण गतिविधियों की जांच के लिए उपग्रह सेल के डिब्बों को regenerating के लिए दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के योगदान की जांच करने के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी regenerating प्रेरित.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, मौन उपग्रह कोशिकाओं को आसानी collagenase पाचन और सतह एंटीबॉडी की मध्यस्थता एमएसीएस जुदाई से चूहों की वयस्क कंकाल की मांसपेशी से शुद्ध किया जा सकता है. इस विधि में लगभग 6 घंटे का समय लगता है और ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Myf5 + / nLacZ चूहों को उपलब्ध कराने के लिए डा. Shahragim Tajbakhsh धन्यवाद. हम भी इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए अलेक्जेंडर Hron और माइकल Baumrucker धन्यवाद. इस काम पेशी Dystrophy एसोसिएशन (एमडीए) और ग्रेगरी Marzolf जूनियर एमडी केंद्र पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
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