يشتغل المغناطيسي النائية متري تحقيقات ل<em> في الموقع</em> رسم الخرائط 3D من البكتيريا بيوفيلم الخصائص الفيزيائية
Summary
يبين هذه الورقة منهجية الأصلي على أساس يشتغل النائية من الجزيئات المغناطيسية المصنفة في بيوفيلم البكتيرية وتطوير ملاقط المغناطيسي مخصص لقياس في الموقع الخواص الميكانيكية المحلية من المادة الحية المعقدة التي بناها الكائنات الحية الدقيقة في الواجهات.
Abstract
التصاق البكتيريا والنمو على واجهات تؤدي إلى تشكيل ثلاثي الأبعاد هياكل غير المتجانسة يسمى الأغشية الحيوية. وتعقد الخلايا مسكن في هذه الهياكل معا عن طريق التفاعلات المادية بوساطة شبكة من المواد البوليمرية خارج الخلية. الأغشية الحيوية البكتيرية تؤثر العديد من الأنشطة البشرية وفهم خصائصها أمر حاسم لتحسين السيطرة على تنميتها – صيانة أو القضاء – اعتمادا على نتائج سلبية أو المنفعة الخاصة بهم. وتصف هذه الورقة منهجية جديدة تهدف إلى قياس في الموقع الخصائص الفيزيائية المحلية من بيوفيلم التي كانت، حتى الآن، درست فقط من منظور المواد العيانية ومتجانسة. التجربة الموصوفة هنا ينطوي على إدخال الجزيئات المغناطيسية في بيوفيلم المتزايد على البذور المحلية تحقيقات التي يمكن دفعتها عن بعد دون إزعاج الخصائص الهيكلية للبيوفيلم. كانت ملاقط مخصصة المغناطيسي ديفيمتخطى لممارسة القوة تعريف على كل الجسيمات جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم. هي التي شنت الإعداد على مسرح المجهر لتمكين تسجيل الوقت الفاصل بين الصور من فترة سحب الجسيمات. ثم يتم استخراج مسارات الجسيمات من تسلسل سحب ويتم اشتقاق المعلمات اللزجة المحلية من كل منحنى النزوح الجسيمات، وبالتالي توفير التوزيع المكاني 3D من المعلمات. اكتساب نظرة ثاقبة بيوفيلم الشخصي الميكانيكية أمر ضروري من وجهة مهندس وجهة نظر لأغراض المراقبة بيوفيلم ولكن أيضا من منظور الأساسية لتوضيح العلاقة بين الخصائص المعمارية وعلم الأحياء محددة من هذه الهياكل.
Introduction
الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجتمعات من البكتيريا المرتبطة السطوح البيولوجية أو اصطناعية 1-3. انهم يشكلون بواسطة آلية التصاق النمو إلى جانب إنتاج السكاريد الغنية المصفوفة خارج الخلية التي تحمي واستقرار الصرح 4،5. هذه الأغشية الحيوية ليست مجرد تجمعات من الخلايا السلبي عالقة على الأسطح، ولكن النظم البيولوجية المعقدة الديناميكية المنظمة و. عند التبديل من البكتيريا العوالق لنمط الحياة بيوفيلم، ويلاحظ التغيرات في التعبير الجيني وعلم وظائف الأعضاء المحمولة، فضلا عن زيادة مقاومة مضادات الميكروبات لاستضافة والدفاعات المناعية يجري في أصل العديد من الالتهابات المستمرة والمزمنة 6. ومع ذلك، فإن التنمية التي تسيطر عليها هذه الهياكل يعيشون توفر أيضا فرصا للتطبيقات الصناعية والبيئية، مثل المعالجة البيولوجية من مواقع النفايات الخطرة، والبيولوجية الترشيح من المياه الصناعية أو تشكيل حواجز الحيوي لحماية التربة والمياه الجوفية من كونتامانأوجه.
بينما الميزات الجزيئية محددة لطريقة بيوفيلم الحياة موصوفة على نحو متزايد، وآليات القيادة وتنمية المجتمع واستمرار تزال غير واضحة. استخدام التطورات الحديثة على قياسات الميكروسكيل باستخدام المسح الكهروكيميائية أو مضان المجهر، وقد ثبت أن هذه المنظمات الذين يعيشون لعرض كبيرة الهيكلية والكيميائية والبيولوجية التجانس 7. حتى الآن، وحتى الآن، والميكانيكا بيوفيلم وقد تم فحص أساسا ظاهريا. على سبيل المثال، مراقبة اللافتات بيوفيلم تشوه بسبب الاختلافات في معدلات تدفق السوائل 8،9، ضغط ذو محورين من القطع المتوسط بيوفيلم رفع من أجار أو نمت على غطاء ينزلق 10،11، والقص من بيوفيلم جمعها من البيئة ومن ثم نقلها إلى مواز لوحة مقياس غلفاني 12،13، القوة الذرية الطيفي باستخدام حبة الزجاج والمغلفة مع بيوفيلم البكتيرية تعلق على ناتئ فؤاد 14 أو ميكر مخصصطريقة ocantilever لقياس قوة الشد من شظايا بيوفيلم فصل 15،16 تم تنفيذها خلال السنوات العشر الأخيرة، وتوفير معلومات مفيدة عن طبيعة اللزجة من المواد 17. ومع ذلك، يبدو من المرجح أن المعلومات المتعلقة بيوفيلم في الخواص الميكانيكية الموضع يتم فقدان عندما تتم إزالة المواد من بيئتها الأصلية، والتي كان الحال في هذه النهج في كثير من الأحيان. وعلاوة على ذلك، ومعاملة بيوفيلم كمادة متجانسة يفتقد المعلومات على التجانس ممكن من الخواص الفيزيائية داخل المجتمع. وبالتالي، لا يمكن ان اعترف آثار الدقيق للهيكل الميكانيكا في تشكيل بيوفيلم والصفات البيولوجية مثل الزخرفة التعبير الجيني أو التدرجات الكيميائية. في التقدم نحو وصف الميكروسكيل من بيوفيلم الخصائص الفيزيائية، هناك حاجة إلى أدوات جديدة مخصصة.
تفاصيل هذه الورقة مقاربة الأصلي تصور لتحقيققياس المعلمات الميكانيكية المحلية في الموقع، من دون إزعاج بيوفيلم وتمكين الرسم للتوزيع المكاني للخصائص المواد الميكروسكيل ثم عدم تجانس الميكانيكية. مبدأ التجربة تقع على المنشطات من بيوفيلم المتنامية مع المجهرية الدقيقة المغناطيسي تليها التحميل الخاصة بهم عن بعد باستخدام ملاقط المغناطيسي في بيوفيلم ناضجة. النزوح الجسيمات تحت رقابة تطبيق القوة المغناطيسية تصوير تحت المجهر تمكن المحلية الاشتقاق المعلمة اللزجة، كل جسيم الإبلاغ البيئة المحلية الخاصة بها. من هذه البيانات، يمكن استخلاص الشخصى 3D الميكانيكية للبيوفيلم، وكشف المكانية والبيئية الإعتماد الشرط. سيتم عرض التجربة كلها هنا على E. بيوفيلم القولونية التي أدلى بها سلالة معدلة وراثيا تحمل مثل F-البلازميد مزال الكظم. النتائج بالتفصيل في ورقة حديثة 18 تقديم رؤية فريدة من الداخل ميكانيكا بيوفيلم سليمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الجسيمات المغناطيسية البذر وسحب تمكين تعيين 3D الموقع من المعلمات اللزجة من بيوفيلم نموا في حالته الأصلية في التجربة. وكشف هذا النهج عدم التجانس الميكانيكية للE. القولونية بيوفيلم نمت هنا وأعطى القرائن أن نشير إلى مكونات بيوفيلم دعم بيوفيلم الخصائ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل في جزء بدعم من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية صب لا بحوث، برنامج PIRIbio Dynabiofilm وCNRS من المخاطر البرنامج المتعدد التخصصات. نشكر فيليب Thomen لله قراءة نقدية للمخطوطة وكريستوف Beloin لتوفير E. سلالة بكتيريا المستخدمة في هذا العمل.
Materials
| Table 1: Reagents and cells | ||||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter | |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | ||
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | ||
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline | ||
| Table 2: Capillaries and tubing | ||||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | ||
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm | |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1mm | |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3mm | |
| Table 3: Biofilm growth | ||||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | standard medium used to grow bacteria | |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose | |
| Table 4: Electronics | ||||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | ||
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | ||
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | ||
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | ||
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | ||
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | ||
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | ||
| Table 5: Optics | ||||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | ||
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth | ||
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. | |
| Table 6: Image analysis | ||||
| ImageJ | NIH – particle tracker plugin | |||
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
- Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
- Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
- Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
- Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
- Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
- Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
- Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
- Guélon, T., Mathias, J. -. D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, (2011).
- Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
- Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
- Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
- Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
- Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
- Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).
