のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動<em>その場での</em細菌バイオフィルム物性> 3Dマッピング
Summary
本論文では、細菌バイオフィルムと、その場で界面で微生物によって構築された複雑な生活材料の局所的な機械的特性を測定するための専用の磁気ピンセットの開発に播種磁性粒子の遠隔操作に基づいて、元の方法論を示しています。
Abstract
インターフェイス上の細菌の付着と成長が3次元不均質な構造、いわゆるバイオフィルムの形成につながる。これらの構造の住居の細胞は、細胞外高分子物質のネットワークが介在する物理的な相互作用によって一緒に保持されている。細菌バイオフィルムは、多くの人間の活動に影響を与え、その性質を理解することは、彼らの開発のより良い制御のために重要である – 保守または根絶 – 彼らの有害または有益な結果に依存。本稿では、今まで、唯一の肉眼的および均質材料の観点から検討、 その場にあったバイオフィルムの局所的な物性を測定することを目指して新たな方法論を説明します。ここに記載された実験は、リモートでバイオフィルムの構造特性を乱すことなく作動させることができるローカルなプローブをシードする成長バイオフィルムに磁性粒子を導入することを含む。専用の磁気ピンセットDEVEたバイオフィルムに埋め込まれた各粒子に定義されている力を発揮するloped。セットアップは、粒子引上げ期間のタイムラプス画像の記録を可能にするために顕微鏡のステージに取り付けられている。粒子軌道はその後引っ張っ配列から抽出され、ローカル粘弾性パラメータは、これにより、パラメータの3次元空間分布を提供し、各粒子変位曲線から誘導される。バイオメカニカルプロファイルに洞察を得ることは、アーキテクチャの特性と、これらの構造の具体的な生物学の間の関係を明確にするために、バイオフィルム制御のためのビューの技術者の視点からだけでなく、根本的な観点から必要不可欠である。
Introduction
細菌バイオフィルムは、生物学的または人工表面1-3に関連する細菌の共同体である。彼らは建物4,5を保護し、安定化多糖類を多く含む細胞外マトリックスの生産と相まって接着成長機構によって構成している。これらのバイオフィルムは、表面に付着した細胞の単に受動的な集合体ではなく、組織化され、動的な複雑な生物系。細菌が浮遊性のバイオフィルムのライフスタイルに切り替えると、遺伝子発現および細胞生理の変化が観察されただけでなく、抗菌剤に対する耐性を増加させ、多くの持続的かつ慢性感染症6の原点にあること免疫防御をホストしている。しかし、これらの生活の構造の制御された開発はまた、有害廃棄物処理場のバイオレメディエーション、工業用水やcontaminから土壌·地下水を保護するためのバイオ障壁の形成のバイオろ過などの産業や環境のアプリケーションのための機会を提供ATION。
生活のバイオフィルム方法と特定の分子の機能がますます記載されているが、地域社会の発展と持続性を駆動するメカニズムは不明である。走査型電気化学または蛍光顕微鏡を用いてマイクロスケール測定に関する最近の進歩を用いて、これらの生体組織はかなりの構造的、化学的および生物学的な異質7を示すことが示されている。しかし、今までは、バイオメカニクスは、主にマクロ的に検討されている。例えば、バイオフィルムストリーマの観測は、流体の流量8,9の変化による変形、バイオフィルム片の一軸圧縮を寒天培地から持ち上げたり、カバーをして10,11、環境から収集されたバイオフィルムのせん断および並列に転送をスライド上で増殖プレートレオメーター12,13、AFMカンチレバー14または専用MICRに付着した細菌バイオフィルムとガラスビーズおよびコーティングを使用した原子間力分光法15,16は、材料17の粘弾性の性質に関する有用な情報を提供し、最後の10年間に実施されてきた離脱バイオフィルム断片の引張強度を測定する方法ocantilever。しかしながら、材料はしばしば、これらのアプローチであった場合、その天然の環境から取り出されたとき、その場バイオフィルムの機械的特性の情報が失われる可能性が高いようである。また、均質な材料としてバイオフィルムの治療は、コミュニティ内での物理的性質の可能性のある不均一性に関する情報をミス。したがって、構造バイオフィルム形成における力学とそのような遺伝子発現のパターニングまたは化学的勾配のような生物学的特性の正確な影響はほとんど認められないことができる。バイオフィルムの物理的性質のマイクロスケールの記述に向けて進行し、新たな専用のツールが必要です。
本論文では、達成するために考案さ独創的なアプローチを詳述バイオフィルムを妨害し、マイクロスケールの材料特性の空間分布の描画した後、機械的な不均一性を可能にすることなく、 その場での局所的な機械的パラメータの測定、。実験の原理は、成熟したバイオフィルムの磁気ピンセットを使用してリモートローディングが続く磁性微粒子と成長しているバイオフィルムのドーピングにかかっている。顕微鏡下で画像化され、制御磁気力作用下の粒子変位は、地元の粘弾性パラメータ導出、独自のローカル環境を報告し、各粒子を可能にします。これらのデータから、バイオフィルムの機械的な3Dプロファイルは、空間的および環境条件依存性を明らかにし、引き出すことができる。実験全体を大腸菌にここに表示されます大腸菌バイオフィルムは抑制解除のF様プラスミドを有する遺伝子改変株によって行われた。最近の論文18に詳細な結果は、無傷のバイオメカニクスの内部のユニークなビジョンを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この磁性粒子は、播種し、元の状態で成長しているバイオフィルムの粘弾性パラメータをその場で 3Dマッピングで有効になって実験を引っ張って。このアプローチは、Eの機械的な不均一性を明らかにした大腸菌バイオフィルムは、ここで増殖させ、細胞外マトリックスに強く、より正確には架橋の程度の基本的な意味を示唆し、バイオフィルムの物理的特性…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、部分的には通信社国立からの補助金によって支えられてLAルシェルシュ、PIRIbioプログラムDynabiofilmを注ぎ、CNRS学際リスクプログラムから。我々は、 大腸菌を提供するための原稿の彼の重要な読書のためのフィリップThomenとクリストフBeloinに感謝本研究で使用した大腸菌株 。
Materials
| Table 1: Reagents and cells | ||||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter | |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | ||
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | ||
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline | ||
| Table 2: Capillaries and tubing | ||||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | ||
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm | |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1mm | |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3mm | |
| Table 3: Biofilm growth | ||||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | standard medium used to grow bacteria | |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose | |
| Table 4: Electronics | ||||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | ||
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | ||
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | ||
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | ||
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | ||
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | ||
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | ||
| Table 5: Optics | ||||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | ||
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth | ||
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. | |
| Table 6: Image analysis | ||||
| ImageJ | NIH – particle tracker plugin | |||
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