のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動<em&gt;その場での</em細菌バイオフィルム物性&gt; 3Dマッピング

サマリー

本論文では、細菌バイオフィルムと、その場で界面で微生物によって構築された複雑な生活材料の局所的な機械的特性を測定するための専用の磁気ピンセットの開発に播種磁性粒子の遠隔操作に基づいて、元の方法論を示しています。

要約

インターフェイス上の細菌の付着と成長が3次元不均質な構造、いわゆるバイオフィルムの形成につながる。これらの構造の住居の細胞は、細胞外高分子物質のネットワークが介在する物理的な相互作用によって一緒に保持されている。細菌バイオフィルムは、多くの人間の活動に影響を与え、その性質を理解することは、彼らの開発のより良い制御のために重要である - 保守または根絶 - 彼らの有害または有益な結果に依存。本稿では、今まで、唯一の肉眼的および均質材料の観点から検討、 その場にあったバイオフィルムの局所的な物性を測定することを目指して新たな方法論を説明します。ここに記載された実験は、リモートでバイオフィルムの構造特性を乱すことなく作動させることができるローカルなプローブをシードする成長バイオフィルムに磁性粒子を導入することを含む。専用の磁気ピンセットDEVEたバイオフィルムに埋め込まれた各粒子に定義されている力を発揮するloped。セットアップは、粒子引上げ期間のタイムラプス画像の記録を可能にするために顕微鏡のステージに取り付けられている。粒子軌道はその後引っ張っ配列から抽出され、ローカル粘弾性パラメータは、これにより、パラメータの3次元空間分布を提供し、各粒子変位曲線から誘導される。バイオメカニカルプロファイルに洞察を得ることは、アーキテクチャの特性と、これらの構造の具体的な生物学の間の関係を明確にするために、バイオフィルム制御のためのビューの技術者の視点からだけでなく、根本的な観点から必要不可欠である。

概要

細菌バイオフィルムは、生物学的または人工表面^1-3に関連する細菌の共同体である。彼らは建物^4,5を保護し、安定化多糖類を多く含む細胞外マトリックスの生産と相まって接着成長機構によって構成している。これらのバイオフィルムは、表面に付着した細胞の単に受動的な集合体ではなく、組織化され、動的な複雑な生物系。細菌が浮遊性のバイオフィルムのライフスタイルに切り替えると、遺伝子発現および細胞生理の変化が観察されただけでなく、抗菌剤に対する耐性を増加させ、多くの持続的かつ慢性感染症⁶の原点にあること免疫防御をホストしている。しかし、これらの生活の構造の制御された開発はまた、有害廃棄物処理場のバイオレメディエーション、工業用水やcontaminから土壌·地下水を保護するためのバイオ障壁の形成のバイオろ過などの産業や環境のアプリケーションのための機会を提供ATION。

生活のバイオフィルム方法と特定の分子の機能がますます記載されているが、地域社会の発展と持続性を駆動するメカニズムは不明である。走査型電気化学または蛍光顕微鏡を用いてマイクロスケール測定に関する最近の進歩を用いて、これらの生体組織はかなりの構造的、化学的および生物学的な異質^7を示すこと^が示されている。しかし、今までは、バイオメカニクスは、主にマクロ的に検討されている。例えば、バイオフィルムストリーマの観測は、流体の流量

プロトコル

1。細菌培養および懸濁製剤

1. 溶原性ブロス（LB）寒天プレートから新鮮に成長したコロニーを選び、5ミリリットルで100μグラム/ mlのアンピシリンおよび7.5μグラム/ mlのテトラサイクリンを含む液体LB培地をそれに接種し、37℃のオンで​​5〜6時間のためにそれをインキュベート揺れプラットフォーム。
2. その後、最小培地（M63B1）は0.4％グルコースと同じ抗生物質濃度を補っ5ミリリットル中の細菌培養の100μLを追加します。揺れプラットフォーム上で37℃で、この新たに希釈した培養を一晩培養する。
3. インキュベーションの16時間後、5ミリリットルM63B1、0.4％グルコースに一晩培養μlの100を追加します。 0.5 ODに達するまで揺れプラットフォームに37℃でチューブを保管してください。サスペンションは、バイオフィルム形成のための実験チャネルに注入するための準備ができる。

2磁気粒子調製

1. 10μlの磁性粒子を取る -直径2.8μM -在庫から、それらを磁気サンプルラックを用いて190μlの最小培地中で3倍洗う。
2. 5×10 ⁶ビーズ/ mlに粒子濃度を調整します。典型的に洗浄し、ビーズ溶液の50μlを、0.4％グルコースを有するM63B1のさらなる950μ

結果

典型的な分析は、元の配置を乱すことなく、生きている生物膜上にミクロンスケールでの粘弾性パラメータの空間分布を提供する。弾性コンプライアンス- -深さに沿っおよびバイオフィルムの横方向寸法に沿ってy軸、z軸の関数として与えられる典型的な結果は、J ₀の値は、図7に示されている。各ポイントは、クリープ曲線分析は、J ₀の値を提供したビーズに対応している。データは、ほぼ3桁以上のバイオフィルムの深さに沿って地元のコンプライアンスが変化していることを明らかにしただけでなく、その強い横異質性は、すべての生物膜の高さで行われた。

データはまた、バイオフィルムの機械的特性によって支持されたという強い指示を与える、ここに広範で非対称な形状（ 図8）を示したコンプライアンス値の分布へのアクセスを与え非常に高分子ゲルを架橋。実際、類似の挙動は、以前に濃縮され、高度に架橋されたアクチンゲル²³で実証されている。

また.......

ディスカッション

この磁性粒子は、播種し、元の状態で成長しているバイオフィルムの粘弾性パラメータをその場で 3Dマッピングで有効になって実験を引っ張って。このアプローチは、Eの機械的な不均一性を明らかにした大腸菌バイオフィルムは、ここで増殖させ、細胞外マトリックスに強く、より正確には架橋の程度の基本的な意味を示唆し、バイオフィルムの物理的特性を支持するバイオフィルムの成分を指摘する手がかりを与えた。

細菌バイオフィルムでの機械的性質のパターンの認識は、これらの複雑な材料の総合的な表現を構築するために重要です。これらの知見は、機械的なパターンや、バイオフィルムの開発を支える原動力の明確化に役立つはずの遺伝子発現microniches、のような生物学的不均一を結ぶ因果関係を明確にする道を開く。

これまで、バイオメカの質問nicalプロパティは、ビューのマクロな観点から、主に対処し、多くの場合、情報損失の重要なリスクを表し、その最初のサイト^{8,9,12.......}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Table 1: 試薬と細胞
磁性粒子	生命技術	14307D	マイクロメトリック磁気粒子, 2.8 & マイクロ;m直径
アンピシリン(抗生物質)	シグマ・アルドリッチ	A9518
テトラサイクリン(抗生物質)	シグマ・アルドリッチ	87128
細菌株MG1655gfpF	UGB、パスツール研究所、フランス		ピシリンとテトラサイクリンに耐性のある表面でFピリを生成します。
表2:
小児灌流用フィルター	Prodimed-Plastimed	6932002
中空正方形の毛細血管	複合金属科学	8280-100	ホウケイ酸ガラスで製造されています。正方形 0.8 mm x 0.8 mm
チューブ シリコーン過酸化水素	VWR 国際	228-0512	直径 1 mm
チューブ シリコーン過酸化水素	VWR 国際	228-0700	直径 3 mm
表 3: バイオフィルム成長
リソジェニーブロス (LB) 溶液	Amresco-VWR	J106-10PK	細菌の増殖に使用される標準培地。
M63B1溶液	自家製		バクテリアを育てるために使用される標準的な最小培地。
グルコース	Sigma-Aldrich	G8270	0.4%グルコースを含むM63B1培地を作るために使用されます。
Table 4: 電子機器
カメラEMCCD	浜松	C9100-02
ヒーターコントローラー	世界の精密機器	300354
機能発電機	アジレントテクノロジー	33210A
パワーアンプ	自作		最大4Aの振幅の電流信号を提供します。
シリンジポンプ	Kd Scientific	KDS-220
シャッター	Vincent Associates	Uniblitz T132
磁気ピンセット	自家製		2つの電磁極、それぞれ直径0.56mmの銅線と軟磁性合金コア(Supra50-Arcelor Mittal、フランス)の2,120回転の銅コイルでできており、図10に示されている青写真に従って正方形に成形されています。2つのコアは、キャピラリーの長さに沿って一方向に磁力を発生させるために、南極に面してN極に取り付けられています。コイルの配線の詳細については、図 11を参照してください。
Table 5: 光学
系倒立顕微鏡	ニコン	TE-300
S Fluor x40 対物レンズ (NA 0.9, WD0.3)	ニコン		深部のバイオフィルムを観察できる長距離対物レンズです。
落射蛍光フィルター:1)緑色蛍光の場合:Exc 480/20 nm;DM495;EM 510/20 2)赤色蛍光の場合:Exc 540/25 nm;DM565;Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	力を加えることによる粒子の変位は、赤いfluoresecnceフィルターブロックを使用して記録されます。
Table 6: 画像解析
ImageJ	NIH - 粒子追跡プラグイン

アンズ